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毕赤酵母表达铜锌超氧化物歧化酶中试工艺研究 总被引：1，自引：0，他引：1
正交设计优化铜锌超氧化物歧化酶毕赤酵母在摇瓶及30L发酵罐的诱导表达条件,用两步层析法纯化表达的目的蛋白,在不同温度下进行原液稳定性试验。用考马斯亮蓝检测蛋白含量,活性检测试剂盒检测目的蛋白活性。纯化后原液参照中华人民共和国药典三部2005版进行检测,用SDS-PAGE、HPLC检测纯度,免疫印迹法检测rhCu,Zn-SOD特异性,等点聚焦测定该酶等电点,地高辛法检测残余DNA含量,酶联免疫法测定残余蛋白含量。结果显示正交试验的大罐高密度发酵最适条件比摇瓶的最适条所获得的目的蛋白活性高8倍,纯化后,HPLC纯度为99.7%,原液比活性大于6.0×103 U/mg,各项检测指标达到生物制品检定标准。该酶在45、65、85、100℃的半衰期分别为240、120、30、15。具有良好的酶稳定性。本研究建立了发酵、纯化的中试工艺,获得高表达、高纯度及高比活的铜锌超氧化物歧化酶,为规模化生产奠定了基础。 相似文献
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设计铜锌超氧化物歧化酶酵母偏爱密码子并化学合成,与pPIC9K连接,构建酵母偏爱密码子的铜锌超氧化物歧化酶基因真核表达载体;通过电转化和持续加压筛选毕赤酵母GS115高拷贝转化子,获得重组高表达酵母菌株建立主种子批。经Southern blot鉴定,高拷贝基因比低拷贝高2～8倍,表达活性高2～4倍。重组菌的目的基因拷贝数与表达产物呈正相关;表达产物为二聚体,相对分子质量为40 000左右,低糖基化,均为分泌表达。West-ern blot法分析,对Cu,Zn-SOD抗体具有特异性反应。转化子在培养16h后进入对数生长期,24h后进入生长稳定期;转化子培养20h左右进行诱导表达最为合适。Cu,Zn-SOD转化子用正交试验筛选摇瓶的诱导表达条件,经诱导表达,Cu,Zn-SOD表达上清最高活性大于600U/mL。确立最适摇瓶培养条件为pH6.0,30℃,1.5%甲醇诱导浓度诱导72h上清的目的蛋白表达最好。高拷贝的3株重组菌经50次传代后插入的目的基因保持稳定。本研究为中试工艺研究奠定了基础。 相似文献
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