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徐淮山羊H-FABP基因克隆、表达产物亚细胞定位的研究及转基因小鼠的制备 总被引：1，自引：0，他引：1
旨在克隆徐淮山羊心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)基因的cDNA,探讨其生物信息学功能。通过EGFP融合蛋白对该基因亚细胞水平的表达定位,探究该基因在异种生物体内表达情况,探索制备异种转基因动物的可能性。采用反转录PCR(RT-PCR)方法克隆徐淮山羊H-FABP基因cDNA,进行生物信息学分析,构建其融合表达载体pEGFP-H-FABP。脂质体(LTX)介导基因转染山羊成纤维细胞(GEF),48h后进行荧光检测,RT-PCR检测mRNA在细胞内的表达。利用睾丸注射将目的基因转入小鼠体内,在DNA和蛋白水平上检测目的基因的表达情况。结果,徐淮山羊H-FABP基因完整编码区(CDS)大小为402bp,编码133个氨基酸,GenBank登录号为AY466498.1。徐淮山羊H-FABP序列与人、鸡、褐家鼠、奶牛、野猪、驴及斑马鱼相应编码区同源性为89%、76%、85%、84%、93%、91%、70%,氨基酸序列同源性为90%、79%、88%、97%、95%、94%、72%。成功构建融合表达载体pEGFP-H-FABP,目的基因在mRNA水平上成功表达。目的蛋白定位于细胞质中,与在线预测结果相同(无信号肽,定位于细胞质中)。通过尾静脉注射和睾丸注射,该基因可以在小鼠体内实现暂态表达和持续性表达。本研究成功克隆了徐淮山羊H-FABP基因cDNA,而且H-FABP基因在进化过程中是保守的。该蛋白无信号肽,在单细胞水平上可表达于细胞质中,在小鼠体内也可以成功表达。 相似文献
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为深入探讨黄芪和板蓝根对湖寒杂交F1代育肥羊的生长发育性能、屠宰管理性能、血液机体免疫功能和机体抗氧化功能的影响，将60只体重相近[（17.42±2.02）kg]的小尾寒羊和湖羊的杂交F1代公羊，随机分为4组，每组15只，分别为空白组和试验Ⅰ、Ⅱ组和Ⅲ组。空白组饲喂基础日粮，试验组分别在基础日粮中添加0.3%黄芪、0.3%板蓝根和0.3%黄芪板蓝根的混合添加剂。试验结果显示：试验组较空白组相比，育肥羊的初始体重、末重和平均日增重均差异不显著（P ＞ 0．05)|试验Ⅱ、Ⅲ组料重比较空白组分别降低 12.6%、14.5%（P ＜ 0.05），试验Ⅲ组总增重较空白组提高21.7%（P ＜ 0.05）|试验组与空白组相比，育肥羊的宰前活重、胴体重和屠宰率等指标均无显著性差异（P > 0.05），试验Ⅰ组和Ⅲ组的脾脏质量均高于空白组|试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组IgA较空白组分别提高27.6%、65.2%、29.9%（P ＜ 0.05），试验Ⅱ组IgA较试验Ⅰ组和试验Ⅲ组分别提高29.4%、27.2%（P ＜ 0.05），试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组IgG较空白组分别降低33.6%、45.0%、 46.1%，差异性显著（P ＜ 0.05），试验I组和试验II组IgM显著高于空白组（P ＜ 0.05），试验Ⅲ组IgM高于空白组，但差异不显著（P > 0.05）|试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组总抗氧化能力（T-AOC）较空白组分别提高39.5%、38.4%、31.4%（P ＜ 0.05），谷胱甘肽（GSH）较空白组分别提高30.8%、40.8%、 47.1%（P ＜ 0.05），丙二醛（MDA）较空白组分别提高73.8%、69.0%、 75.0%（P ＜ 0.05），而试验Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组总超氧化物歧化酶（T-SOD）较空白组分别降低22.7%、28.0%、 24.1%（P ＜ 0.05）。说明在育肥羊基础日粮中添加0.3%的黄芪和0.3%的板蓝根均能提高育肥羊生产性能、屠宰率，改善机体的免疫功能和抗氧化性能。
[关键词] 湖寒杂交F1代育肥羊|黄芪|板蓝根|生产性能|免疫指标 相似文献
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【目的】通过建立过表达MyoD1基因山羊胎儿成纤维细胞系研究MyoD1基因的异位表达研究其在成肌分化中的生物作用。【方法】采用RT-PCR从激活的骨骼肌卫星细胞中克隆MyoD1基因,并将其cDNA终止密码子TGA定向突变为GGA,定向克隆至带有增强型水母绿色荧光蛋白（ehanced green fluorescent protein,eGFP）报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,构建融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1,经过酶切、测序鉴定后,采用LipofectiminTM LTX转染山羊胎儿成纤维细胞（goat embryonic fibroblast,GEF）以建立MyoD1异位表达细胞株并采用成肌诱导分化培养液进行成肌诱导分化,探究MyoD1在成肌过程中的生物学功能。【结果】成功克隆山羊MyoD1基因,并在MyoD1 的开放阅读框（ORF）两端引入XhoⅠ/EcoRⅠ酶切位点,将其终止密码子TGA定点突变为GGA,定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体,获得融合蛋白表达载体pEGFP-MyoD1;经G418（400 μg•mL-1）筛选2周后,获得MyoD1异位表达的GEF细胞株;间接免疫荧光（indirect immunofluorescence assay,IFA）检测结果显示该细胞株能够表达Myf-5等成肌相关免疫学标志;采用成肌分化培养基分化培养处理2—3 d可见少量肌管产生,并表达MyoG、Desmin和MyHC等早期成肌分化标志,处理5 d可见大量肌管形成。【结论】成功克隆出山羊MyoD1基因,构建了pEGFP-MyoD1真核表达载体并建立过表达MyoD1 GEF细胞系,过表达MyoD1 GEF系能够在成肌诱导培养液诱导形成肌管。 相似文献
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【目的】基于前期绵羊肉用性状GWAS研究结果,旨在探讨RIPK2基因对乌珠穆沁绵羊生长性状的影响,找到该基因中与绵羊生长性状相关的分子标记,同时对GWAS结果进行验证。【方法】在343只乌珠穆沁绵羊试验群体中,选取其中30个个体的血液DNA样本,以相同浓度组成池DNA,设计引物对RIPK2基因外显子及其上下游1 000bp的调控区进行PCR扩增,PCR产物检测为目的条带后测序。使用DNAMAN和Chromas2软件对测序峰图进行分析,采用飞行质谱方法对检测到的SNP位点及前期GWAS得到的SNP位点进行基因型分型。使用Haploview软件对多态位点构建单倍型及连锁不平衡分析。使用SPSS （22.0）软件进行RIPK2基因SNP位点与生长性状间的关联分析。【结果】共发现了4个多态位点,A5536G的同义突变rs01位于第四外显子内,在该位点检测到三种基因型,AA基因型频率为0.42,AG基因型频率为0.45,GG基因型频率为0.13,优势等位基因为A,其频率为0.65;在第七外显子上检测到T8952C错义突变rs02,在该突变位点检测到3种基因型,其中TT基因型频率为0.82,TC基因型频率为0.16,CC基因型频率为0.02,T为优势等位基因,基因频率为0.9;在第十外显子检测到 T2836C的突变rs05,在该位点检测到两种基因型TT和CC,没有检测到杂合子基因型,TT基因型频率为0.25,CC基因型频率为0.75;上游调控区发现一个G5181C的突变rs30,有3种基因型,其中GC基因型频率为0.50,CC基因型频率为0.18,GG基因型频率为0.32,G为优势等位基因,其频率为0.58; GWAS得到的SNP位点是T4456C,在本研究中被命名为rs34,在该位点有3种基因型,其中TT基因型频率为0.49,TC基因型频率为0.37,CC基因型频率为0.14,优势等位基因T的频率为0.68。χ2适合性检验发现,除rs34位点外,其余位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05)。rs02位点处于低度多态(PIC＜0.25),其余位点处于中度多态(0.25＜PIC＜0.5)。连锁不平衡分析发现,rs01和rs02位点强连锁,在群体中共构建了3种单倍型,AT 为优势单倍型,其频率为0.645,这两个位点共构建了6 种基因型组合,其中AATT为优势基因型组合,频率为0.425。单标记关联分析表明：rs01位点的AA、AG基因型的个体和GG基因型个体在4月龄体重、胸围上差异显著（P＜0.05）,在6月龄体高、胸围上差异显著(P＜0.05)。rs02位点CC基因型个体在4月龄体重、体高、胸围和6月龄胸宽上显著优于TT、TC基因型个体（P＜0.05),在4月龄体斜长、6月龄体高和体斜长上极显著优于TT、TC基因型的个体（P＜0.01）。rs30位点上,GG基因型的个体在4月龄体重、胸围与其他两种基因型个差异显著(P＜0.05),3个基因型的个体在6月龄胸围上均有显著差异（P＜0.05）。rs34位点的3个基因型的个体仅在4月龄体重上差异显著(P＜0.05)。rs01-rs02组合基因型关联分析发现：GGCC基因型组合的个体在4月龄体重、体高、体斜长、胸围上与其他基因型之间差异显著（P＜0.05）,GGCC基因型组合的个体在6月龄体高、体斜长、胸宽上与其他基因型组合的个体差异显著（P＜0.05）。【结论】RIPK2基因对绵羊生长性状具有较显著的影响,其SNPs作为分子标记对乌珠穆沁绵羊生长性状的选育具有一定的指导意义。 相似文献
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采用外科手术方法从山羊四肢肌肉或背最长肌获取3mm×3mm肌肉束,置于1mg.mL-1 IV胶原酶中,室温消化30min,分散肌丝,在体视显微镜下分离肌丝;再用0.25%胰酶-EDTA于37℃下消化10min,以释放出骨骼肌卫星细胞(SSC)和其他细胞。连续5代在增殖培养体系(80%DMEM/F12+10%胎牛血清+10%马血清)中采用差速贴壁方法,收集接种后20min的贴壁细胞,对纯化的SSC采用免疫荧光方法检测SSC特异标志蛋白Pax-7,结果表明:(92.5±3.4)%细胞表达Pax-7,(93.0±1.8)%细胞表达MyoD,说明90%以上细胞为SSC。将纯化的SSC细胞分别在诱导培养体系Ⅰ(93%DMEM/F12+1%胎牛血清+1%马血清+1%non-AA)和II(99%Opti-MEM+1%non-AA)中进行诱导培养,通过细胞形态学观察和成肌细胞早期标志蛋白Desmin、MyHC免疫荧光检测诱导效果,结果表明:采用体系Ⅱ能在各种细胞密度(大于1×105个.cm-2)下诱导山羊SSC向成肌方向分化,而采用体系Ⅰ(低血清培养基)且仅当能诱导高密度山羊SSC向成肌方向分化。采用改进的SSC分离方法能够获得较高纯度的卫星细胞,比较诱导体系Ⅰ、Ⅱ认为,诱导培养体系Ⅱ适合于山羊SSC成肌诱导分化,为进一步研究SSC成肌分化机制提供素材。 相似文献
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旨在挖掘控制绵羊尾型的候选基因,揭示绵羊尾部脂肪沉积机理。本研究利用呼伦贝尔羊两个不同尾型品系的288个个体,其中大尾羊142只和小尾羊146只,基于Illumina Ovine SNP 600KSNP芯片数据计算全基因组单点F_(ST)值。通过三次光滑样条估计方法确定可变窗口大小和数量,构建W统计量并进行统计检验,鉴定选择区段和注释相关基因。结果,在基因组范围内共确定了23 144个可变窗口,其中区间最大的窗口位于chr12:35 241 750~43 798 950bp处,其大小为8.56 Mb,并包含775个SNPs。经检测发现,27个窗口达到极显著水平(P0.001),并鉴定了337个候选基因,其中22个是与已发现的脂肪代谢相关的基因。通过GO分析发现,这些候选基因主要富集在细胞内组成成分、有机氮化合物代谢过程以及小分子代谢过程等条目。通过可变窗口F_(ST)法能够有效检测到受选择的基因与绵羊尾部脂肪沉积相关。这些基因可以作为绵羊尾型选育的候选基因,为培育短尾绵羊提供重要依据。 相似文献