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为快速、高效构建伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)糖蛋白E基因(gE)缺失病毒,基于CRISPR/Cas9基因编辑技术,首先将pSpCas9(BB)-2A-GFP荧光质粒转染至VERO细胞和PK-15细胞,选出转染效率较高的细胞系,同时于http://crispr.mit.edu/网站设计并合成3个高评分的小导向RNA(small guide RNA,sgRNA),通过噬斑形成试验,筛选出高效sgRNA。其次将筛选出的针对PRV gE基因的sgRNA转染于PK-15细胞,然后接种PRV-1病毒,经过5轮噬斑克隆纯化获得PRV-1-ΔgE。结果显示:VERO细胞比PK-15细胞具有更好的转染效果;gE-sgRNA1和gE-sgRNA2可作为针对gE基因的高效sgRNA;获得了1株PRV gE基因缺失291 bp的病毒,将其命名为PRV-1-ΔgE。研究表明,CRISPR/Cas9基因编辑技术可作为一种高效编辑PRV-1缺失病毒基因的方法,同时也为后续快速应对PRV变异株研究提供了新思路。 相似文献
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为分析羊种布鲁氏菌Rev.I株的基因结构、功能及作为诊断抗原的可能性,从Rev.I株基因组中扩增eryA基因片段,构建重组质粒pET-30a-eryA并进行原核表达、Western-blot检测,同时对该基因进行生物信息学分析。结果显示:本试验成功克隆并表达了eryA基因;经Western-blot检测发现,该基因编码蛋白可与阳性血清发生特异性反应,具有良好的免疫原性;生物信息学分析显示,该蛋白没有跨膜区结构,无信号肽,二级结构中α-螺旋比重最大;抗原表位分析显示:该蛋白含有较多的抗原决定簇。因此,推测eryA蛋白有望作为布鲁氏菌的免疫诊断抗原,这为进一步探索布鲁氏菌基因工程疫苗的研制及iELISA诊断试剂盒的建立奠定了基础。 相似文献
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牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV)引起牛发热、腹泻、黏膜糜烂溃疡等症状，给养牛业带来严重经济损失，新型疫苗的研发意义重大。狂犬病病毒(rabies virus, RV)作为病毒载体可稳定表达外源蛋白，反过来外源蛋白也不会阻碍病毒的复制。本研究目的是利用反向遗传操作技术构建和拯救表达BVDV结构蛋白的重组RV,以期获得一种能表达高水平BVDV E2蛋白的重组病毒。选择Ⅰ型BVDV主要优势抗原E2蛋白基因序列进行优化后合成E2基因片段，利用Overlap PCR的方法将E2基因改造为DE2片段，以RV疫苗毒株LBNSE为病毒载体，利用BsiWⅠ和NheⅠ酶切位点，将DE2基因插入LBNSE基因组中，成功构建pRV-DE2重组质粒。脂质体法将全长重组质粒转染BSR细胞后，拯救重组病毒RV-DE2,并用直接免疫荧光和RT-PCR的方法对其鉴定，对构建成功的病毒进行生长特性、致病性、重组蛋白表达特性等生物学特性和小鼠体内免疫效力的研究。结果表明，RV-DE2病毒滴度在F3代之后趋于稳定，在相同的培养条件下比亲本LBNSE病毒滴度高。重组病毒对小... 相似文献
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