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【目的】试验旨在获得高效表达的鼠伤寒沙门菌SptP蛋白并进行生物信息学分析,为其功能研究和互作蛋白的筛选提供理论依据。【方法】通过PCR技术扩增SptP基因,并将该序列连接至pET-32a （+）载体,构建鼠伤寒沙门菌SptP基因原核表达载体pET32a-SptP。通过热激法将重组质粒导入大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞后经IPTG诱导表达、纯化重组蛋白,并经过SDS-PAGE和Western blotting验证;应用在线软件对SptP蛋白进行生物信息学分析。【结果】PCR成功扩增出大小为1 632 bp的SptP基因。SptP重组蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中成功诱导表达、纯化,得到分子质量为79.7 ku的蛋白。SptP蛋白分子式为C2625H4257N745O812S25,分子质量为60 047.68 u,无跨膜结构,无信号肽存在,理论等电点为8.75,有57个潜在的磷酸化位点,主要定位于细胞核、细胞质、高尔基体、细胞骨架、分泌系统的囊泡、质膜,占比分别为43.5%、34.8%、8.7%、4.3%、4.3%和4.3%。SptP蛋白二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角及无规则卷曲组成,占比分别为43.65%、14.92%、4.42%和37.02%。【结论】本研究构建了表达SptP蛋白的重组质粒pET32a-SptP,获得分子质量为79.7 ku的SptP重组蛋白,阐明了SptP蛋白的基本理化性质和生物学功能,为后续SptP蛋白与宿主细胞互作的作用机制及鼠伤寒沙门菌新疫苗的制备提供理论基础和试验依据。 相似文献
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为获得可以区分自然感染和疫苗免疫且毒力较弱的布鲁氏菌候选疫苗株,本实验研究了磷酸葡萄糖变位酶基因(pgm)对布鲁氏菌(Brucella melitensis)M5-90疫苗株毒力的影响,并对其进行了免疫评价。本实验构建了重组质粒pGEM-7zf-Δpgm,电转化布鲁氏菌M5-90感受态细胞,筛选获得布鲁氏菌疫苗株M5-90的pgm基因缺失株(Δpgm),并对获得的M5-90 Δpgm株进行遗传稳定性、免疫原性检测。结果显示,Δpgm能稳定传15代;Δpgm组的抗体含量较亲本株M5-90组差异不显著;Δpgm在诱导机体产生IL-2的能力要强于M5-90,产生INF-γ的能力低于M5-90;该基因缺失株采用虎红平板凝集试验和试管凝集试验不发生凝集反应;Western blot证实,Δpgm不能诱导小鼠产生抗pgm蛋白的抗体。本研究构建的Δpgm具有很好的遗传稳定性和免疫原性,为研制布鲁氏菌基因缺失疫苗提供了实验依据。 相似文献
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为了构建牛布鲁菌S2308(简称S2308)的铁转录调控因子rirA基因突变株(S2308ΔrirA),探讨该基因对自身生长的影响以及其对不同类型细胞黏附侵袭和胞内繁殖的作用。利用同源重组和抗性替换的方法,以卡那抗性基因替换rirA基因,获得突变株S2308ΔrirA。将亲本株S2308、疫苗株RB51和突变株S2308ΔrirA在相同营养条件下培养,观察其振荡培养时的生长变化趋势和静置培养时的聚集状态。将各菌株侵染人胚胎滋养层细胞(HPT-8)和小鼠巨噬细胞(RAW264.7),分别检测其黏附侵袭能力和胞内生存能力。结果显示,成功获得了布鲁菌rirA基因突变株且10代内未发生回复性突变;与亲本株相比,S2308ΔrirA在相同体外培养条件下其生长趋势未发生明显改变,且其凝集状态与亲本株类似;黏附侵袭试验显示,S2308ΔrirA对HPT-8细胞的黏附侵袭能力显著强于亲本株,而其对RAW264.7的黏附侵袭能力在一定程度上弱于亲本株;布鲁菌胞内生存试验发现,布鲁菌侵染HPT-8细胞24h后,其胞内细菌数量显著升高,而侵染巨噬细胞24h后,S2308ΔrirA的繁殖能力明显低于亲本株。这些结果表明,铁转录调控因子rirA基因参与了布鲁菌胞内寄生的过程,并与菌株的毒力强弱存在密切联系。 相似文献
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