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应用RT-PCR技术从猪外周血单个核细胞扩增转化生长因子β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）全基因,构建含有TGF-β1基因及EGFP报告基因的真核表达质粒pEGFP-C1-TGF-β1。采用脂质体法转染体外培养的猪脐静脉内皮细胞（SUVECs）后,通过直接荧光观察pEGFP-C1-TGF-β1融合蛋白在细胞中的分布定位,并通过RT-PCR、间接免疫荧光方法检测TGF-β1基因在SUVECs中的表达。结果在转染后1周观察到绿色荧光,RT-PCR、间接免疫荧光法检测TGF-β1表达均为阳性。本研究成功构建了含有绿色荧光蛋白基因的真核表达载体pEGFP-C1-TGF-β1,且TGF-β1基因在SUVECs中获得表达。 相似文献
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用不同浓度TGF-1β对猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC)进行诱导,研究体外诱导SUVEC向平滑肌细胞分化的可能性。倒置显微镜下观察诱导前后细胞形态的变化,并采用免疫细胞化学SP法对细胞表面特异性标志物进行染色。结果表明,诱导后细胞失去内皮细胞典型的铺路石样形态,而呈现出肌成纤维样细胞;对诱导后的细胞进行免疫组化检测,发现5～10ng.mL-1 TGF-1β诱导后,平滑肌特异性蛋白-αSMA的相对表达量均显著升高;而浓度升高为20 ng.mL-1时,升高不显著;内皮细胞特异性标志(F-ⅧRAg)的表达均显著下降。该研究表明TGF-1β可诱导猪脐静脉血管内皮细胞向肌样细胞分化,但诱导分化的能力与TGF-1β的浓度有关。 相似文献
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【目的】探讨猪骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)的体外分离培养方法,并对猪BM-SCs的生物学特性进行研究,旨在建立一种稳定的体外培养猪BMSCs的方法体系。【方法】分离刚出生猪的BMSCs进行体外培养,传代,分别观察原代及传代细胞的形态和分化特征,绘制生长曲线,测定细胞分裂指数和贴壁率。采用细胞免疫化学染色对碱性磷酸酶(ALP)进行检测,以确定成骨分化能力,并通过免疫组化法对表面分子CD44、CD34进行染色鉴定。【结果】猪BMSCs体外生长良好,细胞接种后1~2 d生长缓慢,2~5 d进入对数生长期,6 d后细胞数开始下降;猪BMSCs在第4天分裂指数最高,约为10%;猪BMSCs传代后10 h贴壁率最高,达90%以上。猪BMSCs ALP染色阳性率达到75%;CD44阳性率可达98.83%,而CD34在第2代后消失;猪BMSCs在第5代以前生长形态稳定,培养至7代后,衰老现象严重。【结论】该方法分离的猪BMSCs早期生长性状稳定,增殖速度快,并获得了高纯度的猪BMSCs,据此建立了一种稳定的体外培养猪BMSCs的方法体系。 相似文献
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转录靶向猪瘟病毒3′-UTR shRNA细胞株干扰猪瘟病毒增殖的检测 总被引：1，自引：0，他引：1
对筛选的转录猪瘟病毒石门株3-′UTR shRNA的PK-15细胞株P-1（114-132位）、P-2（136-154位）和P-3（209-227位）分别接种猪瘟病毒（CSFV）,在接毒后第72和96小时用半定量反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测CSFVNS3基因及-βactin基因,以研究构建细胞株在转录水平上对CSFV增殖干扰的效果;接毒后第72、96和148小时以酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测细胞NS3蛋白表达量,通过OD490值分析构建细胞株在病毒蛋白表达水平上对CSFV增殖的影响。检测结果表明：（1）接毒后第72和96小时P-1、P-2和P-3细胞株中NS3基因的量明显减少,与接毒的空白PK-15细胞比较差异显著（P〈0.05）,说明P-1、P-2和P-3细胞株转录的shRNA能干扰CSFV RNA的转录;（2）接毒后第72和96小时P-1、P-2、P-3细胞株中NS3蛋白的表达量明显少于接毒的PK-15细胞（P〈0.05）,说明转录的shRNA在病毒蛋白水平上能干扰CSFVNS3基因的表达,但接毒后第148小时干扰效果有所降低。 相似文献
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