猪轮状病毒VP4基因重组腺病毒的构建及抗体水平评价     

肖莉  牛小杰  刘庆庆  王月丽  陈创夫  易继海 《中国畜牧兽医》2023,50(1):260-269

【目的】构建猪轮状病毒（Porcine rotavirus,PoRV）流行株PoRV G9P[23]型的VP4基因重组腺病毒,为开发PoRV候选基因工程疫苗奠定基础。【方法】参考GenBank中流行株PoRV G9P[23]型的VP4基因序列（登录号：MH898990.1）合成PoRV VP4基因,将得到的目的基因与腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV进行重组,转化大肠杆菌Top10感受态细胞,构建腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV-VP4;腺病毒穿梭载体经过Pme Ⅰ内切酶线性化处理后与含有腺病毒骨架pAdEasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组获得重组质粒pAd-VP4,对重组质粒进行Pac Ⅰ酶切鉴定,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。将重组质粒转染HEK293A细胞获得重组腺病毒rAd-VP4,对该重组腺病毒进行扩大培养并测定重组腺病毒的半数组织培养感染剂量（TCID₅₀）;通过RT-PCR检测其体外表达情况,Western blotting检测其反应原性;将制备的重组腺病毒用不同病毒滴度和不同免疫次数对小鼠进行腹腔免疫,收集血清通过ELISA法测定IgG抗体水平。【结果】RT-PCR扩增出1条大小为2 343 bp的rAd-VP4重组腺病毒条带,测序结果正确,表明重组腺病毒rAd-VP4构建成功,测得rAd-VP4病毒滴度为10^6.5 TCID₅₀,Western blotting结果表明,重组腺病毒rAd-VP4在蛋白水平上得到了正确表达,蛋白的分子质量约为87 ku。小鼠IgG抗体检测结果表明,在用10^6.5 TCID₅₀ rAd-VP4免疫后的第35和42天,小鼠血清中的IgG抗体水平显著高于10^5.3 TCID₅₀ TGE-PED-PRV三联活疫苗IgG抗体水平（P<0.05）;10^6.5 TCID₅₀ rAd-VP4在免疫后第35和42天产生的抗体水平显著高于10^5.5和10^4.5 TCID₅₀ rAd-VP4（P<0.05）,而10^5.5 TCID₅₀ rAd-VP4在免疫后第28天产生的抗体水平显著高于10^6.5和10^4.5 TCID₅₀ rAd-VP4（P<0.05）。10^6.5 TCID₅₀ rAd-VP4的2次免疫和3次免疫产生的IgG抗体在不同免疫时间均差异不显著（P>0.05）。【结论】本研究成功构建了重组腺病毒rAd-VP4,其病毒滴度为10^6.5 TCID₅₀。10^6.5和10^5.5 TCID₅₀ rAd-VP4分别在第42和28天产生较高的IgG抗体水平,2次免疫和3次免疫对产生IgG抗体水平均无显著影响。试验结果可为开发PoRV重组腺病毒候选疫苗提供参考。  相似文献   

黑豆中花色苷的研究进展          下载免费PDF全文

牛小杰  孙鲁阳 《现代农业研究》2021,(11):48-49

黑豆具有高营养低能量等优点，研究发现黑豆的花色苷又具有抗氧化、防疲劳、延缓衰老等作用。本文就是对黑豆中花色苷的提取方法，纯化方式以及生物活性等进行简单总结。  相似文献   

鸡白痢沙门氏菌IPAJ蛋白的表达纯化、多克隆抗体制备及ELISA方法的建立     

牛小杰  徐明国  肖莉  刘文豪  陈创夫  王勇 《中国畜牧兽医》2023,(3):1218-1228

【目的】试验旨在建立以鸡白痢沙门氏菌的毒力相关基因所编码的IPAJ蛋白为抗原的间接ELISA方法。【方法】PCR扩增IPAJ基因并连接到pCzn1表达载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPAJ基因重组蛋白用IPTG进行诱导表达并纯化,通过Western blotting验证蛋白的反应原性。用纯化的IPAJ蛋白免疫60日龄试验兔,共免疫3次,制备其多克隆抗体,通过ELISA方法检测抗体效价。采用方阵滴定法优化以IPAJ蛋白作为诊断抗原的ELISA条件,初步建立以IPAJ蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法,并与平板凝集试验结果进行比较。【结果】试验成功构建鸡白痢沙门氏菌IPAJ原核表达载体,并以包涵体形式纯化出重组蛋白,具有良好的反应原性。Western blotting分析结果显示,成功表达出32 ku的IPAJ蛋白,具有良好的特异性。间接ELISA检测结果显示,多克隆抗体效价为1∶25 600,表明成功制备出多克隆抗体。建立的以IPAJ蛋白为诊断抗原的间接ELISA方法的最佳优化条件为：抗原包被浓度为5μg/mL,5%脱脂奶粉封闭1.5 h,一抗最佳稀释浓度为1∶250...  相似文献