大肠杆菌对奶牛子宫内膜上皮细胞炎性损伤的研究     

李博通  王仕宇  刘佳玮  张玮琪  倪耀娣  刘明超 《中国畜牧兽医》2021,48(7):2627-2634

试验旨在研究大肠杆菌（E.coli）对奶牛子宫内膜上皮细胞（bovine endometrial epithelial cells,BEECs）的体外炎性损伤,探究大肠杆菌引发炎性反应的最佳浓度、作用时间及机制。首先,用不同浓度的大肠杆菌（5×10⁴、5×10⁵、1×10⁶、2.5×10⁶、5×10⁶ CFU/mL）诱导刺激细胞3、6和9 h,通过倒置显微镜观察细胞形态、CCK-8法测D_{450 nm}值,检测大肠杆菌对细胞活性的影响;其次,用不同浓度的大肠杆菌（5×10⁴、5×10⁵ CFU/mL）处理细胞3、6和9 h,用ELISA方法检测细胞上清液中白介素-1β（IL-1β）、IL-6、IL-8和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的分泌量;最后,用不同浓度的大肠杆菌（5×10⁴、5×10⁵ CFU/mL）处理细胞6和9 h,用Western blotting检测核因子κB抑制蛋白α（IκBα）和p65蛋白的磷酸化水平。结果显示,与对照组相比,大肠杆菌感染细胞9 h后,1×10⁶、2.5×10⁶和5×10⁶ CFU/mL大肠杆菌组细胞活性均极显著降低（P<0.01）,5×10⁵ CFU/mL大肠杆菌组显著降低（P<0.05）;大肠杆菌感染细胞9 h后,5×10⁵ CFU/mL大肠杆菌组IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α极显著升高（P<0.01）;大肠杆菌感染细胞6 h后,5×10⁵ CFU/mL大肠杆菌组IκBα、p65蛋白磷酸化水平和IL-6均极显著升高（P<0.01）,5×10⁴ CFU/mL大肠杆菌组IκBα和p65蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.05）。结果表明,大肠杆菌可以刺激奶牛子宫内膜上皮细胞产生炎性反应,且当细胞与5×10⁵ CFU/mL大肠杆菌作用6 h或与5×10⁴ CFU/mL大肠杆菌作用9 h为最佳。  相似文献   

原代奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养方法的改进     

王仕宇  李博通  刘佳玮  倪耀娣  刘明超 《中国畜牧兽医》2020,47(3):958-964

目前利用奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养技术，建立奶牛子宫内膜炎模型从而减少不可控因素来研究奶牛子宫内膜炎疾病已成为国内外普遍使用的一类方法，因此获得高纯度、同一性的子宫内膜上皮细胞是体外研究的关键环节，国内外所使用方法主要是酶消化法、组织块贴壁法和组织块消化贴壁法。本文旨对先前的方法进行改良，建立一种简便易行、培养周期短、细胞活性及形态良好的原代奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养技术。采用健康未孕奶牛子宫为试验材料，取下子宫内膜组织，加入5 mL含2%双抗、40%胰酶的DMEM/F12培养基，4 ℃消化12 h，再将组织移至25 cm²细胞培养瓶中贴壁培养。获得原代细胞后，应用角蛋白-18抗体对细胞进行免疫组化荧光鉴定，并对第3代细胞采用CCK-8法测定不同时间点的D_{450 nm}值，绘制细胞生长曲线。结果显示，培养至第8天，原代细胞基本铺满细胞培养瓶瓶底，有效地缩短了常规组织块贴壁法的周期。通过角蛋白-18免疫组化荧光鉴定，原代上皮细胞的阳性率可达98%以上，相比常规组织块贴壁法来说，纯度明显提高，省去了细胞纯化的操作步骤。细胞增殖状态，符合正常的分裂生长特性。试验结果表明将常规组织块贴壁法进行了优化改良，不仅缩短了培养周期，同时提高纯度，保持细胞活性，为原代奶牛子宫内膜上皮细胞体外培养技术的改良提供一定的参考。  相似文献