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通过分子生物学技术克隆萤火虫荧光素酶(Luciferase)基因完整开放阅框后将其定向亚克隆入狂犬病病毒HEP-Flury株全长基因组中的假基因区域,经PCR、双酶切及测序证实构建了嵌有荧光素酶基因的狂犬病病毒全长cDNA感染性克隆。之后,利用反向遗传操作技术进行病毒拯救,抗核蛋白单抗直接免疫荧光染色结果显示,成功拯救了携荧光素酶基因的重组狂犬病病毒rHEP-luc株,RT-PCR证实插入的荧光素酶基因能够稳定遗传;荧光素酶活性分析显示,荧光素酶基因成功表达并具有良好生物学功能;这为应用活体成像技术研究荧光素酶标记狂犬病病毒在小鼠体内侵染移行规律奠定了基础。 相似文献
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反向遗传学(Reverse genetics)是由基因结构认识基因功能的科学,与之相关的研究技术称为反向遗传学技术(Reverse genetic manipulation).RNA病毒的反向遗传学是采用病毒的遗传物质,在培养细胞或易感宿主中重新拯救出活病毒或类似病毒物质.能够拯救病毒的遗传物质称为感染性克隆,一般是在细菌质粒中含有整个病毒基因组的cDNA拷贝,使得cDNA本身或从cDNA体外转录所得的RNA具有感染性.自1978年第1例RNA病毒Qβ噬菌体的成功拯救以来,各类RNA病毒的分子生物学研究取得了长足的进展,这主要归功于各种RNA病毒反向遗传系统的建立和发展. 相似文献
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将携带狂犬病毒糖蛋白单、双拷贝基因的穿梭栽体pShuttle-G和pShuttle-dG分别经PmeⅠ线性化后电转化含E1和E3区缺失的人5型腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的感受态菌株BJ5183-AD-1进行细菌内同源重组,经抗性筛选,PcR、PacⅠ酶切及测序鉴定.构建了狂犬病毒糖蛋白单、双拷贝基因重组腺病毒质粒pAdHu5-G和pAdHu5-dG,线性化后分别转染Ad-293细胞进行病毒包装.结果显示,在第4天发生细胞病变效应,且荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达;western-blot证实2株重组腺病毒表达的糖蛋白能被特异性单抗识别;遗传稳定性分析显示,病毒传至10代时单G和双G基因均稳定遗传,没有发生缺失和突变.为比较分析2株重组腺病毒糖蛋白的表达时效及免疫效果奠定了基础. 相似文献
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提取HEP-Flury株狂犬病病毒RNA,RT-PCR方法扩增糖蛋白G基因,并克隆入pMD18-T载体,进行测序鉴定和序列分析。之后双酶切下G基因,将其亚克隆入腺病毒穿梭载体pShuttle-IRES-hrGFP-1,经卡那霉素抗性、PCR、双酶切及测序鉴定,获得重组单G腺病毒穿梭载体pShuttle-G。应用PCR方法在G基因末端引入口蹄疫病毒2A自剪切肽序列,并克隆入T载体,同时构建含G基因的T载体,分别双酶切回收以上2片段并将他们定向亚克隆入pShuttle-IRES-hrGFP-1,经系列鉴定,成功构建由2A自剪切肽序列连接双G基因的重组腺病毒穿梭载体pShuttle-dG。转染以上2个表达质粒入Ad-293细胞,荧光显微镜观察到GFP的表达,斑点印迹试验结果显示G蛋白成功表达。 相似文献
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为了检测阿米卡星与甲氧苄啶联合用药产生的作用,本试验进行了阿米卡星与甲氧苄氨嘧啶联用的体外抑菌试验。试验菌株为临床分离的猪源致病菌,包括大肠杆菌19株、巴氏杆菌17株和沙门氏菌19株。首先用微量稀释法测定两种药对3种55株病原菌的最小抑菌浓度,根据其最小抑菌浓度值,再用棋盘稀释法测定其FIC指数,判断联合药敏效果。结果表明,在55株细菌对两种药联合药敏试验中,呈协同作用的占72.7%,相加作用的占12.7%,无关作用的占14.6%,无拮抗作用。联合药敏试验中大肠杆菌、巴氏杆菌和沙门氏菌的平均FIC指数分别为0.75、0.43和0.37,均小于1,说明阿米卡星和甲氧苄啶联用有较好的协同作用。 相似文献
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近年来PA28基因的功能研究一直是蛋白酶体功能研究中的一个热点。蛋白酶体(proteasome)是依赖ATP的蛋白水解酶复合体,它分布于细胞质和细胞核内,有些与内质网和细胞骨架相结合,是真核生物细胞中分解内源蛋白质的主要酶系统。它可占细胞蛋白质的1%,在真核生物进化中,蛋白酶体高度保守,其简单形式甚至存在于古细菌和真细菌中。目前对蛋白酶体系统的研究表明,蛋白酶体能够依赖于ATP选择性地降解胞内的短命蛋白(包括细胞周期蛋白,细胞周期抑制蛋白,致癌基因的产物等)和大量的长命蛋白,产生适合于MHCI类分子结合的抗原肽[1]。其次它还可以调… 相似文献
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