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为了在体外获得表达量高、储存容易、成本低且免疫活性高的H9N2亚型HA蛋白,利用水稻胚乳表达系统表达HA蛋白。首先,将HA基因根据水稻偏好密码子进行优化,合成到pUC57载体上,通过双酶切、连接将HA基因先后构建到中间载体pMP3和植物表达载体pCAMBIA1300上;再通过电极法将pCAMBIA1300-HA导入到根癌农杆菌EHA105中;然后用农杆菌侵染TP309水稻愈伤组织;最后经潮霉素筛选、分化、生根、移栽至田间种植。利用CTAB法提取叶片基因组DNA,PCR鉴定T_0阳性植株;利用Dot Blot和Western Blot检测HA蛋白在水稻胚乳中的表达;提取阳性的T_1叶片DNA,通过荧光定量PCR方法筛选纯合植株;利用温汤杀雄剪颖授粉法,将含有HA蛋白的TP309与低谷蛋白水稻杂交;利用Western Blot检测杂交后的T_3植株蛋白表达量;利用双抗夹心ELISA方法比较水稻源和昆虫表达HA蛋白的活性。结果显示,成功构建了中间载体pMP3-HA和植物表达载体pCAMBIA1300-HA,且pCAMBIA1300-HA成功导入到根癌农杆菌EHA105中;PCR检测到有66株植株的HA基因成功整合到水稻基因组;Dot Blot和Western Blot检测结果表明,HA蛋白在水稻胚乳中成功表达;利用荧光定量PCR方法,107株T_1中筛选到31株纯合植株;Western Blot检测结果表明,杂交后的HA蛋白表达量大幅度提高;双抗夹心ELISA结果证实,水稻胚乳表达的HA蛋白的活性高于杆状病毒-昆虫细胞。 相似文献
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自2013年来,猪流行性腹泻病(PED)的暴发给云南省养猪业带来严重的经济损失。本研究对2018年来自云南4个地区的42份病料中分离出的6株猪流行性腹泻病毒(PEDV)的部分S基因进行扩增,并结合在2013年所分离到的来自云南4个地区的4株PEDV流行株,进行分子特征和遗传进化分析。结果显示:这2年的分离株和CV777株相比,2018年分离株的核苷酸和氨基酸突变位点增加了12个和7个,且有3个丝氨酸突变都是在COE结构域(69、101和146)。系统发育分析表明,2018和2013年分离株的核苷酸和氨基酸的同源性为95.6%～98.8%,95%～98.8%;分别与CV777株相比,核苷酸和氨基酸的同源性差异较小(94.9%～95.5%和92.7%～95.4%;94.5%～95.2%和93.4%～94.2%),亲缘关系都较远。2013年的分离株主要分布在G2b亚群,而2018年的分离株主要分布在G2a和G2c亚群,具有遗传多样性。N-糖基化和磷酸化位点预测分析显示,在216位上预测的N-糖基化位点由NSSI→NSSF,尤其是COE结构域中的丝氨酸取代而导致其可预测磷酸化。这些变异很可能会影响其抗原性和疫苗效果,导致PEDV控制效果不好。本研究阐明了云南部分地区PEDV流行毒株的分子流行病学和遗传特征,为该地区PED的防控奠定理论基础。 相似文献
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为调查云南省规模化猪场猪伪狂犬病流行情况,2016—2017年分别采用ELISA和PCR检测技术,对从云南省9个地区54个猪场采集的6 555份全血和381份疑似病料进行了血清学和病原学检测。抗体检测结果显示:血清样品的gB抗体阳性率为88.7%,gE抗体阳性率为13.5%;楚雄市的gB抗体阳性率最低(78.5%),但gE抗体阳性率(野毒感染率)最高(21.8%);大理市的gB抗体阳性率最高(95.1%),但野毒感染率最低(6.0%);第2季度野毒感染率最高,为20.3%。病原学检测结果显示:疑似病料病原检测平均阳性率为23.1%,其中母猪、保育猪和育肥猪分别为28.8%、23.4%和20.4%,公猪精液为25.0%,流产胎儿和仔猪为22.3%;玉溪市的病原检出率最高(52.6%),德宏市最低(16.4%);各季度的病原检出率无明显差异。调查结果表明,猪伪狂犬病在云南省仍有流行,部分地区较为严重,尤其是玉溪、宣威和西双版纳等地区;应重点加强对母猪、保育猪、仔猪以及公猪精液的防控;加强伪狂犬病免疫,提高gB抗体阳性率,有助于预防野毒感染。 相似文献
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