洼地绵羊防御素sBD-1基因克隆、序列分析及SYBR Green Ⅰ实时荧光定量检测方法的建立与应用     

王金良  郭显坡  沈志强  李敏  任艳玲 《中国兽医学报》2011,31(5)

根据GenBank上登录的绵羊防御素基因序列,经多重比较后,设计1对引物,从洼地绵羊舌上皮组织中扩增到防御素sBD-1基因,克隆到pMD18-T载体中进行测序.结果表明,扩增基因全长215 bp,编码64个氨基酸.基因进化树分析表明,与蒙古绵羊sBD-1基因有较近的亲缘关系,核苷酸同源性为98.5%;而与黄牛的亲缘关系最远,核苷酸同源性84.6%.氨基酸序列分析表明,序列内无信号肽区域,具有3个潜在的抗原表位.以pMD18-T/sBD-1质粒为模板建立了sBD-1基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,核酸电泳、扩增动力学曲线、溶解曲线及重复性试验表明,检测方法具有良好的稳定性和特异性,得到的回归方程(R2=0.998)表明PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在良好的线性关系,从舌、盲肠及输卵管等组织中可以进行有效的检测,检测灵敏度为83.9 copies/μL.该方法为进一步研究防御素sBD-1基因在洼地绵羊抗逆性过程中的作用奠定了基础.  相似文献   

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒方法的建立及应用   总被引：1，自引：0，他引：1  

王金良  郭显坡  魏凤  沈志强 《中国兽医学报》2010,30(10)

根据GenBank登录的猪流行性腹泻病毒株FJ473395的M基因序列设计1对特异性引物,经RT-PCR扩增出182 bp的片段。产物经回收与pMD18-T Vector连接后转化到基因工程菌DH5α中,提取重组质粒,经PCR及测序鉴定后,作为阳性模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线,并做敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,产物Tm在85～85.5℃之间,灵敏度为5.875拷贝/μL,特异性和重复性较好。本试验建立了检测PEDV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,为该病的早期诊断,并定量分析PEDV感染程度奠定了基础。  相似文献   

东营地区NDV和IBV分离株遗传分析简     

陈申秒  郭显坡  何福庆  吴雪莉  马景霞 《中国动物保健》2014,(1):43-45

对东营地区规模化肉鸡养殖场近两年送检的病死鸡进行分子检测，确定NDV和IBV的发生率很高，针对具有典型特征的NDV和IBV分离株分别进行了F基因和S1基因的测定和分析，确定为肾型传支和基因7型新城疫，通过与流行毒株和疫苗毒株的分析为以后该地区的防疫提供帮助。  相似文献   

一例肾型鸡传染性支气管炎的诊断   总被引：4，自引：3，他引：1  

陈红英  LI Xin-sheng  段廷云  JIA Yan-yan  郭显坡  CUI Bao-an 《中国畜牧兽医》2008,35(8):120-121

2007年9月,郑州某鸡场发生一起疑似肾型鸡传染性支气管炎。将分离毒株接种20日龄肉鸡,于接种后第4 d出现精神不振、拉稀,第6 d出现死亡。分离病毒可致死部分鸡胚及产生卷曲胚,但不能凝集鸡红细胞,经1 %胰酶处理后能凝集鸡红细胞。经过实验室检查结果结合流行病学调查、临床症状和剖检变化,初步诊断为肾型鸡传染性支气管炎。  相似文献   

SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测猪细小病毒方法的建立及初步应用     

沈志强  王金良  郭显坡  王晓虎  汪明  赵德明 《中国兽医学报》2011,31(1)

根据GenBank登录的猪细小病毒株NADL-2(NC001718)的VP2基因序列设计1对特异性引物,经PCR扩增出431bp的目的片段。回收产物与pMD18-T vector连接后转化到基因工程菌DH5α中,提取重组质粒,经PCR及测序鉴定后,作为标准模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线,并进行敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,R2=0.997 6,产物Tm为82.3～82.9℃,检测灵敏度为72.1拷贝/μL,特异性和重复性良好。本试验所建立的检测PPV VP2基因的SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法,为该病毒的致病机制研究、临床早期诊断及定量分析PPV感染程度奠定了基础。  相似文献   

贵宾犬α-干扰素基因的扩增、克隆与序列分析     

宋亚鹏  陈红英  崔保安  贾艳艳  郭显坡  张蕾 《江苏农业学报》2010,26(2)

参照基因库中收录的犬α-干扰素基因序列设计1对引物,应用PCR技术直接从贵宾犬肝组织基因组DNA中扩增IFN-α基因,将回收得到的特异性片段克隆于pGEM-T Easy载体中,转化感受态细胞DH5α,经蓝白斑筛选,质粒PCR鉴定及酶切鉴定筛选阳性重组质粒,测定其核苷酸序列。测序结果表明,贵宾犬α-干扰素基因全长为564 bp,包含一个完整的开放阅读框,编码187个氨基酸的多肽,推导氨基酸序列有3个潜在的N-糖基化位点,有10个与二硫键形成有关的半胱氨酸。用DNAStar软件将所得序列与人和其他种动物的IFN-α基因进行核苷酸及氨基酸同源性比较,并通过绘制系统进化树可知,IFN-α基因存在种属的差异性,亲缘关系越近,同源性越高。  相似文献   

猪繁殖与呼吸综合征的RT-PCR诊断与防制     

郭显坡  吕晓丽  崔保安  陈红英  魏战勇  贾艳艳  王东方 《畜牧与兽医》2008,40(10)

2007年7月,周口市某猪场发生了一种以初产猪流产、死产为特征的疾病。根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株VR-2332ORF7基因序列设计1对特异性引物,提取流产胎儿的肺、肝等组织中的RNA,经RT-PCR扩增,检测PRRSV为阳性,结合病史和临床症状,诊断为猪繁殖与呼吸综合征。对该猪场采取综合防制措施,取得了较好的效果。  相似文献   

猪伪狂犬病毒SYBR-GreenⅠ实时定量PCR检测方法的建立   总被引：2，自引：1，他引：1  

李明凤  魏战勇  郭显坡  贾艳艳  陈红英  王学兵  崔保安 《河南农业大学学报》2009,43(3)

利用PCR技术扩增出猪伪狂犬病毒gH基因中187 bp的片段,并克隆到pGEM T栽体上,纯化的质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为标准模板,进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线.建立了猪伪狂犬病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达1.26×102拷贝·μL-1,与猪圆环病毒,猪细小病毒,猪繁殖与呼吸综合征病毒,猪瘟病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对15份疑似病料进行了检测.发现均为荧光定量PCR阳性,而常规PCR只能检测出6份阳性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRV感染的检测.  相似文献   

鸡α干扰素基因的克隆、原核表达及抗病毒活性测定   总被引：6，自引：0，他引：6  

陈红英  宋凌云  崔保安  胡功政  贾艳艳  郭显坡 《华北农学报》2009,24(1)

通过PCR技术从罗曼鸡肝脏基因组中扩增鸡α干扰素(ChIFN-α)全基因,并克隆和测序.序列分析表明,ChIFN-α基因全长为582 bp,亚克隆其成熟蛋白编码基因489 bp,利用基因重组技术构建了重组质粒,使ChIFN-α置于原核表达载体pQE30的T5启动子下并同6×His(多聚组氨酸标签)-Tag 融合.经酶切和PCR鉴定,DNA测序证实重组质粒pQEChIFN-α构建正确;将pQEChIFN-α转化大肠杆菌M15感受态细胞,用IPTG诱导表达.SDS-PAGE和Western blot证实表达出分子质量为19.80 kDa的融合蛋白.表达的蛋白以包涵体形式存在,经变性、复性处理后,在Vero细胞上抗水泡性口炎病毒的活性为1.16×103 U/mg.本研究成功表达了ChIFN-α,表达的重组蛋白具有一定的生物活性.  相似文献   

一例鸡鼻气管炎的诊断与治疗     

贾艳艳  崔保安  陈红英  郭显坡  郭小参  吕晓丽  冯利霞 《中国畜牧兽医》2008,35(4):82-83

鸡鼻气管炎是由鼻气管鸟杆菌(ornithobacteri-um rhinotracheale,ORT)引起的呼吸道疾病,也是近年来新发现的一种感染家禽和野鸟的呼吸道疾病,主要表现为鸡采食量减少,生长缓慢,单侧或双侧纤维素性化脓性肺炎、胸膜炎、气囊炎,鸡群死亡率升高,孵化率下降,肉禽增重减少。有些病例  相似文献