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基于中华稻蝗转录组数据库,采用生物信息学方法搜索获得1条OcKnk基因全长cDNA序列,采用qRT-PCR检测其组织部位表达特性和其在表皮发育过程中表达情况,明确其分子特性,采用RNAi技术结合表型观察,研究其对中华稻蝗蜕皮和生长发育的影响,以明确其生物学功能。组织部位表达结果显示其在中华稻蝗体壁、前肠和脂肪体表达最高,发育表达结果显示其在表皮不同发育日龄均有表达,且在蜕皮前期和后期表达显著高于其他日龄。生物学功能研究表明,注射dsRNA后,多数虫体难以成功蜕去旧表皮,导致死亡,少部分可蜕至下一龄期,但活动力较低,行动缓慢,最终死亡。研究结果表明OcKnk参与昆虫生长发育和蜕皮过程,可作为重要靶标基因,为下一步害虫防治提供理论基础。 相似文献
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精细胞膜是一种异质结构,它在维持精子运行、活力和受精能力方面起着极为重要的作用。应用单抗隆抗体研究精子表面的抗原。可以从分子水平深入了解精细胞膜的特性。精子由睾丸的曲精细管生成,然后通过附睾头和附睾尾,最后排出。在这一过程中,精细胞是逐步发育和成熟分化的。可以用高度特异性的单克隆抗体检测这一过程中精细胞抗原位点的分布和变化以及研究精子受精被抑制的机制。 相似文献
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奶牛终生利润能力(lifetime profitab-ility:下称终生利润)与产量、体型和长寿性间的遗传联系至今还不太明确。我们认为,头胎产量是终生产量和长寿性的一个良好预测指标,用48月龄初产母牛的性能评定公牛有助于对公牛父亲终生性状的选择。经济分析表明,当后备牛成本和产奶收入的变化范围很大时,按出生到48月龄女儿的“保留率”(stayabili-ty)进行公牛排队能提高利润。每头公牛有100到200头女儿时测定的保留率就可靠,产量与保留率的相对经济权数约为2∶1。虽然研究尚未得出最终结论,但已表明用体型估测长寿性似乎没有什么价值,远不如保留率有用。但是如果只强调泌乳期产量,而不重视乳房中央悬韧带的选择就可能使母牛出现悬垂乳房。 相似文献
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【目的】LmKnickkopf3-5′(LmKnk3-5′)是飞蝗（Locusta migratoria）蜕皮发育中重要的表皮蛋白。本文旨在制备LmKnk3-5′特异抗体并对其进行组织定位,为LmKnk3-5′生物学功能研究提供蛋白水平的证据,同时为进一步深入探究LmKnk3-5′与其他表皮蛋白在飞蝗表皮形成过程中的协同作用打下基础。【方法】首先比对飞蝗Knickkopf(Knk)家族4个基因LmKnk、LmKnk2、LmKnk3-FL和LmKnk3-5′的氨基酸序列,选取LmKnk3-5′的3段特异抗原序列R1、R2和R3,设计包含BamH I、Hind III酶切位点的引物,以LmKnk3-5′全长cDNA为模板,PCR获得LmKnk3-5′的特异抗原片段;然后将特异抗原片段与pET-32a经双酶切、T4连接酶连接、测序验证、成功构建重组质粒后,转入BL21（DE3）表达菌株中,加入IPTG（终浓度0.5 mmol·L-1）低温（16℃）诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE检测重组蛋白表达情况;接着扩大培养可在菌体裂解液的上清中表达重组融合蛋白的大肠杆菌,提取蛋白并用Ni-NTA对其进行纯化,之后再用纯化后的重组特异抗原免疫小鼠4次,获得anti-LmKnk3-5′多克隆抗体,ELISA法对其进行效价检测,并用Western blot法检测其特异性。取飞蝗5龄若虫第8天表皮,制备石蜡切片,通过免疫组化法对LmKnk3-5′蛋白进行组织定位。【结果】通过氨基酸序列比对,选取LmKnk3-5′的特异抗原区域R1、R2和R3,分别包含208、147和131个氨基酸残基,蛋白理论分子量分别为24.0、17.0和14.8 kD。酶切连接后,成功获得 pET-32a-R1、pET-32a-R2 和pET-32a-R3重组质粒。诱导表达检测,发现只有含pET-32a-R2的表达菌在菌体裂解液的上清液中大量表达重组蛋白。将其扩大培养纯化后获得 R2重组融合蛋白,免疫小鼠取抗血清进行效价检测,抗体效价高达1﹕512 000,可满足抗体使用需求。Western blot结果表明,注射dsLmKnk3-5′后飞蝗体壁LmKnk3-5′的蛋白表达显著减少,表明anti-LmKnk3-5′抗体特异性良好。免疫组化试验结果表明,表皮蛋白LmKnk3-5′在飞蝗腹部体壁皮细胞及新表皮中均有分布,特别是新合成的外表皮顶端。【结论】成功获得飞蝗LmKnk3-5′多克隆抗体,证明其特异性良好。LmKnk3-5′在飞蝗腹部体壁新合成的外表皮顶端分布较多。研究结果为飞蝗表皮蛋白LmKnk3-5′功能研究提供了蛋白水平的证据。 相似文献
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Cd在中华稻蝗体内的分布 总被引：4，自引：2，他引：4
中华稻蝗属于非迁飞性蝗虫,尤其喜食水稻.当水稻生长环境Cd污染严重时,Cd将富集于蝗虫体内.中华稻蝗不同体段对Cd的富集程度不同,在雌性头、胸、腹、后足的富集浓度分别为0.323,O.343,0.486及0.306 mg·kg-1,各体段富集Cd能力大小的顺序为腹＞胸＞头＞后足;在雄性头、胸、腹、后足的富集浓度分别为O.509,0.437,0.738,0.356mg·kg-1,分布状况为腹＞头＞胸＞后足;Duncan的多重比较显示,Cd在中华稻蝗腹部的富集量与在头、胸、后足的富集量差异显著,而头、胸、后足间的富集量差异不显著;Cd在不同性别中华稻蝗腹部的富集量差异显著,但在头、胸、后足中的富集量差异不显著.由于中华稻蝗对Cd有富集作用,因此,可利用中华稻蝗作为Cd的环境污染指示生物,对稻田及周围环境重金属污染进行监测,快速、准确地反映环境中重金属Cd污染状况. 相似文献
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为研究镉毒性与中华稻蝗种群等位酶基因型之间的关系，将采自山西省原平市的中华稻蝗（Oxyachinensis）为研究对象进行镉的LD50急性毒性实验，并对所研究个体进行等位酶水平淀粉凝胶电泳。结果表明，中华稻蝗种群LDH、GPI、PGM和ME均为多态基因座位。在LDH、PGM、ME多态基因座位上，各基因个体的死亡率差异显著（P〈0．05），其中PGM及ME的基因型频率显著偏离哈-温平衡预期值，且LDH、PGM、ME为杂合体缺乏（F〉0）；在GPI多态基因座位上，各基因型个体的死亡率差异不显著（P〉0．05），GPI基因型频率符合哈-温（H-形）平衡预期值，而GPI为杂合体过剩（F〈0）。中华稻蝗在这4个基因座位具有较高的平均每个基因座位的等位基因数（A=2．5），平均观察杂合度（Ho=0．314～0．325）和平均期望杂合度（He=0．471～0．496）。结论：由于中华稻蝗种群不同基因型对Cd^2＋的敏感性不同．因而导致其不同基因型死亡率的差异。 相似文献
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前言哺乳动物胚胎的体外培养至少可以追溯到Brachet 于1913年在比利时所进行的兔囊胚的培养试验.1957年,Whitten 发现用加了牛血清白蛋白(BSA)的生理盐水和乳酸盐配成的简单的“半限性”培养液可以把2-细胞小鼠胚胎培养成囊胚,从而开始了哺乳动物植前胚培养研究的革命.在此之后,用这种培养液培养小鼠胚胎,相继研究出了胚胎冷冻、胚胎显微分割和嵌合及基因移植等多种技术.在两种情况下需要进行牛胚胎的培养。第1种情况是在胚胎冷冻或分割等操作后进行活力检查,要把桑葚胚培养成囊胚。牛胚胎的培养液相当简单,如在含有犊牛或羔羊血清的磷酸盐缓冲液(PBS)中就能很容易地把晚期8-细胞胚胎或桑葚胚培养成囊胚。第2种情况是 相似文献
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【目的】β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-N-acetylglucosaminidase,NAG)是昆虫几丁质降解过程中的重要酶类。研究旨在利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统获得高纯度LmNAG1蛋白并对其酶学特性进行分析,探究该酶在飞蝗(Locusta migratoria)生长发育过程中的生物学功能,为飞蝗绿色防控分子靶标研发提供理论与实践依据。【方法】根据Lm NAG1的cDNA全长序列(Gen Bank:JX888720.1)设计包含酶切位点Bam H Ⅰ、Hind Ⅲ和6×His标签的引物。采用PCR技术扩增包含开放阅读框的目标片段,双酶切后连接至pFast Bac~(TM)-Dual载体上。将重组质粒转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,通过Tn7转座子把目的基因转座到杆状病毒基因组上,用蓝白斑结合抗生素筛选。挑取白斑用pUC/M13引物来扩增目的条带,挑选带目的基因全长的重组杆状病毒质粒(baculovirus plasmid,Bacmid)。用转染试剂将重组Bacmid转染至草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞系Sf9中,72 h内连续观察细胞形态,当出现感染迹象后收集细胞,离心,取上清得到P1代重组病毒粒子。用P1代病毒粒子去感染Sf9细胞,裂解并提取蛋白,Western blot检测目的蛋白是否成功表达。之后大量感染Sf9细胞,提取蛋白,利用Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱和阴离子交换柱Q对重组蛋白进行纯化,取最纯的馏分用Bradford法测定蛋白浓度。采用4MU-GlcNAc为底物对重组目的蛋白LmNAG1的动力学参数、最适温度和最适pH进行测定。【结果】克隆得到包含1 845 bp LmNAG1全长的pFast Bac-LmNAG1重组质粒,酶切验证与目标条带一致。将重组质粒转化至DH10Bac感受态细胞中,PCR扩增挑选出纯白斑,成功将LmNAG1全长序列构建到杆状病毒基因组上。将重组Bacmid转染至Sf9细胞,72 h后在显微镜下观察可见细胞膨大,边缘不规则等感染迹象。离心收集重组病毒粒子感染新的Sf9细胞,72 h后收集细胞,Western blot检测发现在67 kD附近有明显条带,与LmNAG1的理论分子量一致,获得带6×His标签的融合蛋白。大量感染收集细胞提取蛋白,经Ni-NTA琼脂糖层析纯化,进一步透析除盐后用阴离子交换柱Q二次纯化,得到了高纯度的目的蛋白。用Bradford法测定最纯的E3组分的蛋白浓度为0.057μg·μL~(-1)。体外活性测定结果表明LmNAG1的最适pH为8.0,且在pH 6.0—8.0范围内具有较高的稳定性;LmNAG1的最适温度为40℃,在40℃以下具有很高的稳定性,当温度高于45℃时热稳定性迅速下降;采用4MU-GlcNAc为底物测得LmNAG1具有水解β-1,4糖苷键的活性,可以释放出4MU,它的动力学参数K_m值为(0.28±0.02)mmol·L~(-1),K_(cat)值为(902.88±38.15)s~(-1)。【结论】成功获得高纯度且具活性的LmNAG1蛋白,其可水解β-1,4糖苷键连接的几丁质寡糖,与已知昆虫NAG1具有相似的生物学功能,即参与几丁质的降解。 相似文献
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【目的】对重要农业害虫中华稻蝗（Oxya chinensis）羧酸酯酶（carboxylesterases,Ces）家族基因进行生物信息学分析,并对部分基因的组织表达特性进行研究,为揭示中华稻蝗Ces基因功能及研发新的分子靶标提供依据。【方法】基于中华稻蝗转录组数据库,通过关键词搜索获得Ces基因序列,采用生物信息学方法进行比对拼接、氨基酸序列推导和开放阅读框分析,选择全长序列构建系统发育树,采用在线软件分析中华稻蝗Ces氨基酸序列结构、理化性质、信号肽和N糖基化位点等特征。采用实时定量PCR技术,通过geNorm 与Normfinder 软件分析4个候选内参基因β-肌动蛋白（β-actin）、延长因子（EF1α）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）和核糖体蛋白49（RP49）表达稳定性,筛选中华稻蝗5龄若虫不同组织部位最适内参基因并检测10个羧酸酯酶基因在不同组织部位相对表达量。【结果】从中华稻蝗转录组数据库搜索获得Ces基因cDNA片段180个,经筛选获得28个Ces基因全长序列进行生物信息学分析。推导的氨基酸序列与其他昆虫物种的聚类分析结果显示,中华稻蝗28个Ces分布于4个功能簇中,其中A簇直翅目和部分双翅目昆虫α酯酶（20个）、D簇表皮特异酯酶（2个）、E簇β酯酶（4个）和F簇非鳞翅目保幼激素酯酶（2个）。氨基酸序列分析结果显示,中华稻蝗大部分Ces的等电点（pI）均为偏酸性或弱酸性,pI为4.38-6.84,只有3个Ces的pI值偏碱性。中华稻蝗所有的Ces基因都具有N糖基化位点、N端保守的半胱氨酸残基及氧离子洞,信号肽预测结果表明19个Ces具有完整的信号肽;21个Ces具有典型的催化三联体S-E-H,其余7个Ces催化三联体发生了不同的替换。GeNorm与Normfinder分析结果显示,4个候选内参基因稳定性EF1α=RP49＞β-actin＞GAPDH。选择EF1α作为内参基因,RT-qPCR结果显示10个羧酸酯酶基因在7个不同组织部位均有表达,其中OcCesA1、OcCesA6、OcCesA12、OcCesA14、OcCesA18和OcCesA19在中肠和胃盲囊高表达,此外OcCesA6、OcCesA18和OcCesA19还在马氏管高表达,OcCesA2在后肠高表达。OcCesD1在马氏管表达量最高,脂肪体和表皮次之;OcCesE1在胃盲囊表达量最高;OcCesF2在中肠表达量最高。【结论】基于中华稻蝗转录组数据库获得28个全长Ces基因,聚类分析结果显示,这些基因分布于4个功能簇中,其中分布于A簇的基因数目相对较多,且多在中肠、胃盲囊和马氏管等代谢解毒器官中高表达。研究结果为Ces基因功能的深入探索和中华稻蝗Ces基因分子靶标研发提供了依据。 相似文献