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【目的】克隆山黧豆β-腈基丙氨酸合成酶基因(CASase)DNA全长序列,构建CRISPR/Cas9敲除载体,为筛选"低毒、高硫"山黧豆品系奠定基础。【方法】以萌发4d山黧豆幼苗根部为材料,提取其基因组DNA,利用PCR克隆CASase基因全长;经序列同源性、内含子、外显子、sgRNA靶位点和脱靶分析后,在CASasecDNA上选取5个sgRNA靶位点进行寡核苷酸链设计和体外活性检测;从5个sgRNA靶位点中取活性较高的4个sgRNA,利用酶切连接法构建基因敲除载体pPLHACas9-sgRNA20r、pPLHACas9-sgRNA68r、pPLHACas9-sgRNA225f和pPLHACas9-sgRNA256f。【结果】获得了CASase基因3 143bp的DNA全长序列,该序列编码β-腈基丙氨酸合成酶;在CASase cDNA中选取5个sgRNA靶位点在体外均能有效剪切靶序列;菌落PCR检测结果显示,4个CRISPR/Cas9基因敲除载体构建成功。【结论】克隆了山黧豆CASase基因DNA全长,成功构建了该基因上4个sgRNA靶位点的CRISPR/Cas9敲除载体。 相似文献
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以大岩桐(Sinningia specisoa)茎尖组织为试材,采用RT-PCR方法对大岩桐SsKN1(KNOTTED1-like homeobox)基因进行克隆,经BLAST比对、邻接法构建进化树,研究了SsKN1基因与其它KNOXI基因的亲缘关系;并利用半定量RT-PCR,研究了SsKN1基因在大岩桐根、花瓣、花萼、叶、茎和茎尖等不同组织中的表达情况,以期为SsKN1基因的功能研究奠定基础。结果表明:获得了大岩桐SsKN1基因451bp的cDNA序列,该基因与烟草NTH15基因亲缘关系最近,其次为拟南芥STM基因;SsKN1基因在根、叶、茎尖和花萼等4种组织中表达,在花瓣和茎中不表达。其中在茎尖的表达量最高,叶中的表达量次之,根和花萼的表达量较低。 相似文献
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蛋白酶在种子萌发过程中参与了储藏蛋白水解等多种生理过程,为植物的生长发育提供氮源并在种子萌发的生化机制中有重要作用。本研究采用明胶酶谱法检测了山黧豆种子在不同萌发时间的蛋白酶表达情况。利用盐析、离子交换层析等方法从萌发6d的山黧豆种子中分离纯化了蛋白酶并对其基本酶学性质进行了研究。结果表明,山黧豆种子萌发特异性蛋白酶造成了种子萌发过程中高分子质量蛋白质的水解和较低分子质量蛋白质的积累。对纯化蛋白酶进行总蛋白含量、酶活力、酶比活力等检测表明,山黧豆蛋白酶的纯化倍数为6.58,蛋白得率为7.97%。山黧豆蛋白酶对金属离子的耐受性较高,添加Fe3+可以引起蛋白酶活性的显著增加。此外,该蛋白酶对血红蛋白和明胶的反应活性最高,其最适反应pH和温度分别为pH7和60℃。本研究为进一步研究山黧豆种子萌发过程中蛋白质水解与其内源毒素β-N-草酰-L-α,β-二氨基丙酸积累的相互关系奠定了基础。 相似文献
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