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1.
2.
柑桔黄龙病的常规PCR及荧光定量PCR检测 总被引:21,自引:0,他引:21
【目的】为柑桔黄龙病的早期诊断和寄主体内病原菌的动态监测提供一种稳定、可靠的检验检疫技术。【方法】利用亚洲韧皮杆菌核糖体蛋白基因rplJ/rplL设计了2对PCR引物CQULA03F/CQULA03R、CQULA04F/CQULA04R和1条TaqMan探针CQULAP1,以此为基础建立了常规PCR和TaqMan探针法、SYBR Green I荧光染料法两种荧光定量PCR(共3种)反应体系;确定了3种体系各自的检测灵敏度、特异性和准确性,据此对3种体系进行了比较;从2004年7月到2005年5月还利用常规PCR和TaqMan探针荧光定量PCR体系完成了对柑桔黄龙病病原菌在寄主体内的周年变化的动态监测。【结果】两种荧光定量PCR方法的灵敏度比常规PCR高出至少2~3个数量级,而TaqMan探针法由于使用了杂交探针,其特异性尤其可靠,另外两种定量PCR较小的产物片段使得它们具有更好的稳定性,加上荧光定量PCR方法本身受污染可能性小、操作简便等固有优势,使得前者更适合于柑桔黄龙病的检测。【结论】本研究建立的2种荧光定量PCR方法可以为柑桔黄龙病的病害早期诊断以及柑桔黄龙病病原菌近缘种的甄别提供准确、灵敏、快速的检验检疫技术。 相似文献
3.
4.
PCR、DIA与致病性测定法检测柑桔溃疡病菌的比较 总被引:3,自引:0,他引:3
依据柑桔溃疡病菌全基因组序列的独有保守区域设计筛选出的特异性引物对JYF5/JYR5,用于柑桔溃疡病菌的PCR检测,具有很好的检测特异性、灵敏度和稳定性。同时比较了PCR与DIA(斑点免疫结合技术)及传统的致病性测定法在检测灵敏度、稳定性及田间样品检出率等方面的差异。结果表明,PCR的检测灵敏度可达103~104 cfu·ml-1(每个反应体积约10个细菌),明显高于DIA(104~105 cfu·ml-1,每个样点约300个细菌);PCR、DIA和致病性测定法检测田间显症样品的检出率均可达到100%,而检测柑桔无症样品的检出率依次降低。此外,通过排除PCR抑制物质和在PCR反应体系中加入终浓度为15%的甘油,有效地降低了检测中存在的假阴性。 相似文献
5.
【目的】分析柑橘木虱(Diaphorina citri)体内可能与黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)互作的内生细菌,为黄龙病菌的人工培养及其病害防控奠定基础。【方法】首先通过传统分离培养方法比较不同地理来源带黄龙病菌(带菌)和不带菌黄龙病菌(不带菌)的木虱中可培养内生细菌的差异。其次将带菌状况不同的木虱分别分为头、胸、腹3部分,经PCR扩增其16S rDNA的V6-V8区,用变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)方法,比较带菌状况不同的木虱内生细菌的差异和木虱不同部位内生细菌的差异。选择3种差异的内生细菌:Bacillus sp.、Salmonella sp.、Enterobacter sp.,在8份带菌状况不同的木虱样品中通过q-PCR分别对其进行实时荧光定量分析,再以总细菌量为校正计算包括黄龙病菌在内的4种细菌的相对含量,数据经LSD检验,以各种细菌相对含量的-lg值作图,先比较同一样品中3种细菌分别与黄龙病菌的相对含量关系,再比较同种细菌在不同样品中的特性,分析3种内生细菌和黄龙病菌的互作关系。【结果】不带菌木虱中可培养内生菌菌落丰富度和菌落形成单位均大于带菌木虱中。在不带菌木虱中共获得14株形态不同的菌株,分属于芽孢杆菌属(Bacillus,3株)、欧文氏菌属(Erwinia,1株)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella,1株)、葡萄球菌属(Staphylococcus,2株)、节杆菌属(Arthrobacter,1株)、泛菌属(Pantoea,2株)、果胶杆菌属(Pectobacterium,1株)、沙门氏菌属等(Salmonella,1株)、链霉菌属(Streptomyces,1株)、Massilia brevitalea(1株)等10个细菌属。在带菌木虱中分得的4株细菌在不带菌木虱中均分离到,分属于克雷伯氏菌属、芽孢杆菌属、果胶杆菌属。其中Dc-11(嗜气芽孢杆菌属)在带菌木虱和不带菌木虱中分离频率均达到100%,表明其为木虱体内常驻细菌;对木虱不同部位(头、胸、腹)内生细菌16S rDNA的PCR-DGGE图谱显示,带菌与不带菌木虱中细菌种群差别明显,带菌状况相同的木虱不同部位之间差别不明显。其中优势条带10 (Wolbachia sp.)、12(Wolbachia pipientis)、13(Syncytium endosymbiont of Diaphorina citri)、14(Uncultured bacterium)、19(Serratia marcescens)、21和22(均为嗜麦芽寡养单胞菌Stenotrophomonas maltophilia)在木虱体内稳定存在,带菌木虱腹部特有优势内生细菌为Enterobacter sp.,木虱中同样也存在次级内生菌Wolbachia。q-PCR的结果验证了所选的3种细菌在前期传统分离培养和16S rDNA-PCR-DGGE中结果的可靠性,同时表明肠杆菌属在8份样品中与黄龙病菌呈正相关关系。【结论】黄龙病菌进入木虱体内会改变木虱内生细菌菌群种类和结构;嗜气芽孢杆菌(B. aerophilus)在柑橘木虱体内稳定存在,为木虱体内常驻菌群;Enterobacter sp.与黄龙病菌带菌量呈正相关,推测其可能与黄龙病菌互作。 相似文献
6.
7.
世界柑桔溃疡病及其病原菌的研究现状和进展 总被引:4,自引:0,他引:4
自1984年美国农业部以 E.L.Civerolo 为首的小组在佛罗里达发现“柑桔溃疡病”以来,在病原鉴定上一直有争议。经过多年来大量的研究工作,据最新资料证实在佛罗里达为害作砧木用的 Swingle citrumelo 的所谓 E 菌系,不是溃疡病,而应是 Xanthomonascampebtris pv.citrumelo,真正的柑桔溃疡病菌,即 A 菌系,应为 X.citri,而在阿根延、乌拉圭等主要侵染柠檬和墨西哥来檬的假溃疡,即所谓 B 菌系和在巴西只侵染墨西哥柑桔和轻微为害其它来檬等的 C 菌系以及在墨西哥为害墨西哥来檬叶和嫩梢的 D 菌系,均应称为 X.campestris pv.aurantifolii,从而最后澄清了问题。本译文发表于1986年,反映的研究进展尚不多,但评述的较系统全面,有一定参考价值,因此也给于发表。 相似文献
8.
9.
应用斑点免疫技术快速检测柑桔溃疡病菌 总被引:2,自引:0,他引:2
应用改进的斑点免疫技术在国产微孔滤膜上检测柑桔溃疡病菌(Xan-thomonasaxonopodispv.citri)。结果表明,靶细菌检测下限为1×104细胞/ml,柑桔无症材料浸出液稀释(128倍)仍可检出。经柑桔叶面腐生黄单胞及近缘细菌交叉吸收,提高了多克隆抗血清特异性,能有效地避免假阳性。3种HRP-标结结合物的效果为HRP-SpA>HRP-IgG(鼠抗兔)>HRP-IgG(羊抗兔)。封闭液采用TBS+0.1%曲拉通或0.5%吐温20,吐温80均可获得白色滤膜背景。对全国8省38县518个柑桔无症样品DIA检验结果,平均带菌率31.82%,符合实际病情。 相似文献
10.
芽胞杆菌CQBS03抑菌蛋白TasA基因的克隆及原核表达 总被引:1,自引:1,他引:0
为了探讨柑桔溃疡病生防菌芽胞杆菌Bacillus CQBS03菌株TasA基因的功能,采用PCR方法从CQBS03基因组DNA中扩增出编码TasA基因的全长DNA序列,并构建pEASY-E1/TasA原核表达载体,经大肠杆菌Escherichia coli表达获得TasA基因的融合表达蛋白,纸碟法检验融合蛋白对柑桔溃疡病菌Xanthomonas citri citri的抑制作用。结果显示,CQBS03菌株的TasA基因包含1个786 bp的完整开放阅读框(GenBank登录号为JQ309841),编码261个氨基酸残基;该序列与来源于解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens的1个已知同源TasA基因序列FJ713580的相似性达99.75%。原核表达产物经SDS-PAGE分析,检测到约31 kD的融合蛋白;纯化后的融合蛋白对柑桔溃疡病菌有明显的抑制作用,72 h后抑菌圈直径达11.5 mm。研究表明TasA基因是生防菌芽胞杆菌CQBS03抑制柑桔溃疡病菌的功能基因之一,并且该基因对原核表达宿主没有抑制作用,具有较好的开发利用前景。 相似文献