Lipocalin核糖体展示文库的构建及雌二醇特异性模拟抗体的筛选     

刘建青  宁保安  高志贤 《安徽农业科学》2013,(31):12251-12254,12261

[目的]构建Lipocalin核糖体展示文库,并筛选雌二醇特异性模拟抗体。[方法]以Lipocalin蛋白家族中的BBP(胆汁三烯结合蛋白)为模板,设计包含16个随机突变位点的引物,合成BBP基因文库;引入核糖体展示所必需的全部组件,采用重叠PCR技术将BBP库与核糖体展示组件进行拼接,构建核糖体展示Anticalin模拟抗体库;再将构建的Anticalin文库进行体外转录与翻译,产生模拟抗体-核糖体-mRNA三联复合体文库。以小分子抗原雌二醇为靶标,采用固相亲和方法筛选抗雌二醇抗体,通过改变Mg2+浓度将模拟抗体-核糖体-mRNA三联复合体解离,得到与模拟抗体对应的mRNA,经过RT-PCR得到筛选后的DNA文库并重新引入核糖体展示元件进行下一轮淘筛。[结果]通过5轮生物淘筛,模拟抗体得到富集,获得高特异性抗雌二醇抗体。其中有一株克隆的亲和力为54 mmol/L(Kon=4.975 6×104个/M·S;Koff=0.002 7个/S)。IC50与LOD值分别为50和0.071 ng/ml。[结论]获得的雌二醇模拟抗体可以作为抗体并用于检测动物体内雌二醇的残留。  相似文献   

采用磁性纳米微球增强信号的表面等离子体共振免疫传感系统检测水中莠去津残留   总被引：1，自引：0，他引：1  

柳明  彭媛  赵琢  翟自芹  刘磊  王华  张园  白家磊  宁保安  高志贤 《农药学学报》2015,17(6):688-695

将磁性纳米微球(MNP,表面修饰羧基的磁性四氧化三铁微球)与表面等离子体共振(SPR)免疫传感技术结合,以莠去津单克隆抗体(AT-m Ab)与磁性纳米微球的偶联物(AT-m AbM NP)作为传感识别元件,初步建立了一种用于饮用水中除草剂莠去津残留检测的SPR信号增强免疫传感方法。通过对检测条件的优化,该方法对自来水中莠去津的检出限为0.89 ng/m L(S/N=3),检测范围为8.62~7.18×10~3ng/m L,检测时间小于20 min;在10~1 000 ng/m L添加水平内,莠去津的平均回收率为94%~102%,相对标准偏差(RSD)为5.1%~7.3%。磁性纳米微球的加入有效增强了SPR传感器的响应信号强度,提高了检测方法的灵敏度。本研究建立了一种快速、灵敏、准确的水中莠去津残留的检测方法,可为相应的现场检测技术和设备的研发提供技术基础。  相似文献   

核糖体展示模拟抗体Anticalin基因文库的构建及初步鉴定     

刘建青  孙垚  宁保安  李晓芳  高志贤 《农业生物技术学报》2014,22(9)

脂质运载蛋白(lipocalin)是一类广泛存在于生物界的小分子蛋白质家族,具备一些抗体所没有的优点。为了构建库容量大、多样性好的核糖体展示模拟抗体Anticalin文库,本研究以脂质运载蛋白家族之一大菜粉蝶(Pieris brassicae)中提取到的胆汁三烯结合蛋白基因(bilin-binding protein,bbp)(GenBank登录号:X76568.1)为模板,设计了包含16个随机突变位点的引物,采用重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)构建bbp基因文库。然后,利用SOE-PCR法引入核糖体展示元件(T片段与P片段),体外构建核糖体展示模拟抗体Anticalin基因文库。结果表明,本研究成功构建了模拟抗体Anticalin基因文库,其库容达到3.76×1023,文库的可扩增性、完整性及多样性良好,为筛选多种小分子化学残留的模拟抗体提供了基础资料。  相似文献