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为了获得华支睾吸虫成虫期强反应原性抗原基因,首先利用λZAP栽体构建华支睾吸虫成虫cDNA表达文库:即从我国东北疫区(镇赉县)家犬胆管内分离收集华支睾吸虫成虫,采用Trizol Reagent提取其总RNA,Oligo(dT)纤维素柱纯化mRNA,反转录合成第1链cDNA及第2链cDNA,用CHROMA SPIN-400柱离心层析纯化后,与栽体λZAP Express连接,体外包装后成功获得我国东北疫区华支睾吸虫成虫cDNA表达文库.文库容量为1.5×106pfu,重组率为99%,插入片段长度在0.4～2.0 kb之阀,扩增文库的滴度为1.5×1010pfu/mL.然后利用免疫学方法对该cDNA表达文库进行筛选:以自然感染华支睾吸虫的人血清为抗体探针,从2.0×105个重组噬菌体筛选强反应原性抗原基因,对筛选出的强反应原性克隆进行测序,利用相关分子生物学软件进行序列分析.共获得41个阳性克隆,测序结果分析表明,这些cDNAs根据其编码的蛋白可分为以下几种,即与来自华支睾吸虫的甘氨酸-2、脯氨酸-2及Cs44抗原高同源的基因及分别与来自Nematostella vectensis的未知蛋白、转录延伸因子及果蝇CG3446基因编码蛋白较低同源性的基因.本研究结果为进一步对华支睾吸虫抗原的生物学特性研究及应用奠定了理论基础和实验依据. 相似文献
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旋毛虫可感染包括人类在内的150多种哺乳动物,引起的旋毛虫病呈世界性分布。以前本病在欧洲及北美国家严重流行,以后通过严格猪肉检查,人体旋毛虫病的发病率己明显下降,但在过去20年内世界上许多地区又出现了本病的暴发〔1~3〕。目前全世界大约有1100万人体感染者,国际旋毛虫病委员会(International Commission on Trichinellosis,ICT)仅在1995~1997年即报道了1万多例病人〔4,5〕。自1835年发现旋毛虫以后,一直认为旋毛虫属只有一个种,即Trichinella spiralis。近年来的研究发现,不同地区的旋毛虫分离株对外界环境的适应能力、繁殖力、对… 相似文献
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筛选旋毛虫肠道1期幼虫抗原性基因。利用λZAP载体构建旋毛虫肠道1期幼虫cDNA文库。用感染旋毛虫26 d猪血清对其进行免疫学筛选,对筛选出的阳性克隆进行测序与分析;应用RT-PCR方法对编码p46 000蛋白强阳性克隆基因在不同发育时期虫体转录情况进行检测。成功构建了旋毛虫肠道1期幼虫cDNA文库,其库容量为1.5×106pfu,重组率为95%,插入片段在400 bp~2 000 bp之间,扩增后文库滴度为1.5×1012pfu/mL。筛选出阳性克隆33个,序列分析表明,有20个克隆为同一已知基因,称为旋毛虫p46 000蛋白,编码旋毛虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂,且在筛选过程中反应信号均较强;还发现了一些旋毛虫新基因,如编码Ubc蛋白,GM13181蛋白,Rieske硫铁蛋白1等。本研究获得了一个高丰度、反应原性较强抗原基因,其编码蛋白为半胱氨酸蛋白酶抑制剂。 相似文献
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采用基因文库筛选方法克隆了鲤鱼外周血白细胞蛋白酶体激活因子PA28βcDNA,对其序列进行了分析,同时利用半定量反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）方法检测了不同外界因子刺激下鲤鱼外周血白细胞PA28β的表达情况。结果显示,用DD-RTPCR的方法获得差异显示片段A18,经地高辛标记作为探针对有丝分裂原刺激的鲤鱼外周血白细胞cDNA文库进行核酸杂交筛选,从0.8×104个重组噬菌体中,经过两轮筛选获得阳性克隆。序列分析表明,该阳性克隆长1175bp,含有一个大小为735bp编码244个氨基酸的完整开放阅读框,为编码鲤鱼蛋白酶体激活因子PA28β的全长cDNA。系统发生分析其与已报道的斑马鱼蛋白酶体激活因子PA28β亲缘关系最近,基因序列的同源性达95﹪。分离培养鲤鱼外周血白细胞,在不同条件下经PHA和ConA刺激后,利用Trizol提取总RNA,根据得到的PA28β全长cDNA序列和鲤鱼β-actin序列设计引物,利用RT-PCR方法对鲤鱼外周血白细胞PA28β进行差异表达分析,结果表明：经有丝分裂原刺激后前期（4h）白细胞中PA28β的表达量明显增大,但随着时间推移(12h、24h)表达增加量有所降低,并不随时间的延长而持续增加。在刺激的和正常的白细胞中PA28β表达趋势都成抛物线图,不同的是经刺激的比正常的PA28β的表达量提前达到峰值。本文属国内外首次报道鲤蛋白酶体激活因子PA28β的全长cDNA序列,鲤鱼PA28β的cDNA序列GenBank注册号为EU255233,并对其进行差异表达分析,这些结果可为PA28β在鱼类免疫应答中的作用研究提供参考和依据。 相似文献
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