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（目的）研究旨在克隆猪CD163 (pCD163)基因、体外表达CD163蛋白。（方法）采用RT-PCR扩增猪CD163基因，运用生物信息学软件分析其核苷酸和编码氨基酸序列，将猪CD163的两个截短基因片段（1-1749 bp和1717-3348 bp）克隆至原核表达载体pGEX-4T-1，构建重组原核表达载体，转化Transetta(DE3)菌株，IPTG诱导蛋白表达，采用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白鉴定。（结果）结果表明，pCD163开放阅读框为3348 bp(GenBank:OM321546)，编码1116 aa，蛋白分子量为120.5 kDa，该基因与已经测定的人、绿猴、牛、狼的CD163的核苷酸相似性依次为87.8%、88%、87.4%和88%,pCD163基因与抹香鲸和牛的CD163基因亲缘关系最近，与人、狼和绿猴的亲缘关系相对较近；pCD163截短片段1-1749蛋白分子量为92 kDa，截短片段1717-3348蛋白分子量为85 kDa，均以包涵体形式表达。（结论）试验成功克隆了pCD163基因，两个截短基因片段在原核细胞中均以包涵体形式表达，为后... 相似文献
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为表达犬冠状病毒(canine coronavirus, CCV)S1蛋白，制备其特异性小分子抗体Fab,为CCV的防治提供新材料。采用PCR扩增CCV S1基因全长及其截短片段，分别克隆到原核表达载体pET28a或pGEX4T-1中，转到BL21(DE3)或Rosetta(DE3)感受态细胞构建重组表达菌株；用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导目的蛋白表达，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western blot鉴定分析重组蛋白；纯化蛋白分别与ISA71AVG或ISA201VG佐剂配伍乳化后制备免疫原，免疫蛋鸡，用聚乙二醇(PEG)沉淀法提取得到CCV S1蛋白的卵黄抗体，通过Western blot检测抗体滴度，用胃蛋白酶水解卵黄抗体制备小分子抗体Fab。结果显示，S1蛋白全长无表达，CCV S1-a和CCV S1-b分子量分别为79 ku和68 ku。在免疫后第35天2种佐剂组的卵黄抗体滴度可达1∶128 000。制备小分子抗体Fab最佳酶切条件为卵黄抗体与胃蛋白酶混合质量比20∶1、pH值4.1、37℃酶切8 h。完整的IgY可以与CCV呈... 相似文献
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