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HC-Pro基因片段介导的高抗TuMV 总被引：1，自引：0，他引：1
芜菁花叶病毒(turnip mosaic viruses,TuMV)是侵染重要经济作物的主要病毒之一,寄主范围十分广泛,尤其是对十字花科作物的危害最为严重。为了获得对TuMV持久稳定的高度抗性,本研究以TuMV HC-Pro基因的453 bp保守序列为靶标,构建了植物表达RNAi载体pBBBTu-HC-Pro,并转化了TuMV的天然宿主拟南芥。对转基因拟南芥用北京地区流行的TuMV强致病株BJ-C4进行了抗病接种鉴定。鉴定的13个单拷贝转基因株系中有4个对TuMV的BJ-C4株表现出高度抗性,抗性比对照提高约80%以上,且抗性可以稳定遗传。经半定量和荧光定量PCR方法检测,在高抗转基因植株体内几乎检测不到病毒的累积,抗病效果明显。该载体在利用基因工程抗TuMV育种中具有广阔的应用前景。 相似文献
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利用RT-PCR法对广东烟草样品的马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)辅助成分蛋白质(Helpercomponent proteinase,HC-Pro)基因进行了克隆,并对其进行了序列分析。测序结果表明广东PVY HC-Pro(命名为PVY-HC-GD)基因(用PVY-HC-GD表示)全长1 395 bp,编码465个氨基酸。与已报道的PVY HC-Pro基因核苷酸序列相比发现,PVY-HC-GD与PVY NTN株系(PVYNTN)(AB331517)的PVYHC-Pro基因核苷酸序列相似性最高,达99.6%。而氨基酸序列比较表明,PVY-HC-GD与PVY N株系(PVYN)(AM268435)的PVY HC-Pro氨基酸序列相似性最高,为99.1%。进一步将PVY-HC-GD的核苷酸和其编码的氨基酸序列与其他报道的同源基因比对构建了系统关系树,结果显示广东烟草样品中PVY-HC-GD与PVYNTN PVY HC-Pro亲缘关系最近。 相似文献
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芜菁花叶病毒杭州分离物(HZWT)和昆明分离物(YNQC)在7种寄主上的致病性相似.利用IC-RT-PCR对两分离物的CP和HC-Pro基因进行PCR扩增,扩增产物克隆后进行序列测定,CP基因序列长度均为864个核苷酸,编码288个氨基酸;HC-Pro基因序列长度均为1374个核苷酸,编码458个氨基酸.两分离物的CP和HC-Pro基因的核苷酸同源率分别为99.3%和94.5%,氨基酸同源率分别为100%和98.7%.HZWT和YNQC的CP基因与已报道的TuMV其他分离物的核苷酸序列同源率为89.2%～99.3%,氨基酸同源率分别为88.5%～99.7%;HC-Pro基因与TuMV其他分离物的核苷酸序列同源率分别为80.6%～97.0%,氨基酸同源率分别为95.0%～99.6%. 相似文献
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马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)是侵染烟草的最重要病毒之一。不同PVY株系侵染烟草可引起不同症状,有些PVY株系可引起烟草叶脉坏死,严重影响烟草的产量和品质。PVY A12分离物属于NTN-NW株系,但侵染珊西烟(Nicotiana tabacum cv. Xanthi)不能引起叶脉坏死。分析发现,PVY分离物A12 HC-Pro第182和245位的氨基酸均为精氨酸(R),而能引起叶脉坏死的其他NTN-NW分离物HC-Pro的这2个位点均为赖氨酸(K)。PVY坏死株系N605的HC-Pro第182位和245位氨基酸也均为K。本研究通过定点突变,将N605侵染性克隆PVYN605-GFP HC-Pro第245位残基K突变为R,突变体仍然能够引起叶脉坏死,而将其HC-Pro第182位残基K突变为R,突变体不能引起叶脉坏死。Western blot检测发现,2个突变体与野生型病毒CP蛋白在珊西烟中的表达水平没有明显差异。沉默抑制实验结果显示,2个突变体和野生型的HC-Pro抑制RNA沉默能力没有发生变化。初步确定PVYN605-GFP HC-Pro第182残基K是引起叶脉坏死的关键氨基酸,推测PVY A12分离物不能引起烟草叶脉坏死的原因是其HC-Pro第182残基R引起的。 相似文献
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为防治番木瓜环斑病毒(Papaya ringspot virus,PRSV)在我国葫芦科作物上引起的病毒病害,以PRSV西瓜株系山东分离物(PRSV-SD)侵染性cDNA克隆为基础,采用定点突变方法将辅助成分-蛋白酶保守氨基酸137位和346位的天冬酰胺(N)和417位的缬氨酸(V)突变为丙氨酸(A),应用农杆菌浸润法接种西葫芦叶片并分析突变对PRSV-SD致病力的影响,筛选弱毒突变体,进而评价其交叉保护效果。结果表明,与野生型PRSV-SD相比,获得的3个突变体N137A、N346A和V417A,接种后在西葫芦植株上的症状明显减轻,衣壳蛋白在叶片中的积累水平分别为野生型PRSV-SD的24.0%、13.0%和4.0%,均为弱毒突变体。当保护间隔期为10 d时,弱毒突变体N137A具有完全的交叉保护效果,N346A可延迟发病15 d,而V417A无交叉保护效果。当间隔保护期为15 d时,弱毒突变体N137A和N346A的保护效率分别为100.0%和26.7%,而V417A无交叉保护效果。 相似文献
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马铃薯Y病毒属病毒编码的辅助成分-蛋白酶（helper component-proteinase,HC-Pro）是第一个被鉴定的RNA沉默抑制因子。本研究通过定点突变的方法获得了马铃薯A病毒（Potato virus A,PVA）HC-Pro的3个突变体, 利用农杆菌共浸润的方法分析了这些突变对HC-Pro抑制RNA沉默活性的影响。与野生型HC-Pro处理相比,Phe6、Asn11 缺失突变体的处理中绿色荧光减弱,而Ile250-Gly251-Asn252（IGN）基序中的Ile和Gly分别突变为Asp和Glu的处理中观察不到绿色荧光。该结果表明Phe6、Asn11 和IGN250 3个位点均参与调控HC-Pro的抑制RNA沉默活性。 相似文献
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RNAi的抑制物及其应用 总被引：1，自引：0，他引：1
在植物、动物中广泛存在的一种基因调控现象,RNAi现象是通过调控RNA的分子水平来抑制基因表达。被认为是一种抑制病毒性复制和转座子活动的抗御机制。在此过程中,侵染型病毒为了能够不被这种机制干扰抑制,继续在寄主体内生存、繁殖,则产生了一种反抗御机制———即产生抑制蛋白来对抗转录后基因沉默。本文集中讨论了当前已知的植物病毒编码的沉默抑制物。它们在抑制途径中的不同阶段干扰沉默,这些抑制物已成为一种有力的工具来帮助了解植物中RNA沉默的机制,并在研究基因功能等方面有着广泛的应用前景。 相似文献
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甘蔗条纹花叶病毒HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg基因酵母双杂交诱饵表达载体的构建及自激活检测 总被引：2，自引：0，他引：2
为探索甘蔗条纹花叶病毒与甘蔗的互作机制,利用酵母双杂交技术筛选与SCSMV互作的甘蔗因子基因,利用PCR技术克隆了SCSMV的HC-Pro、P3N-PIPO、CP和VPg的编码区,构建到酵母双杂交诱饵载体p GBKT7上,获得了p GBKT7-HC-Pro、p GBKT7-P3N-PIPO、p GBKT7-CP和p GBKT7-VPg 4个诱饵载体。结果显示,将重组质粒转化酵母Y2HGold酵母菌株后,酵母菌株在SD/-Trp平板上生长良好,表明重组诱饵质粒表达产物对酵母细胞无毒性;在SD/-Trp/X-α-gal平板上长出白色菌落未变蓝,在SD/-Leu、SD/-Trp/-Ade、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/X-α-gal/Ab A平板上不能生长,表明重组诱饵质粒表达产物对MEL1、ADE2、HIS3和AUR1-C报告基因无自激活作用。构建的诱饵表达载体可以作为诱饵用于文库筛选,为探索SCSMV侵染机制和发病机理奠定了基础。 相似文献
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通过基因枪(PDS-1000He)轰击法将构建好的多功能蛋白HC-Pro的植物表达载体pHCFL与带PMI筛选标记基因的pZMLR14植物表达载体共转化导入易感花叶病甘蔗品种福农95-1702的胚性愈伤组织中,转化的愈伤经甘露糖筛选后获得抗性转化甘蔗幼苗。经PCR检测、氯酚红显色、RT-PCR检测和DNA点杂交分析获得转HC-Pro的转基因植株,转化率为0.8%(HC-Pro基因)、1.7%(PMI基因)和0.4%(HC-Pro基因+PMI基因)。花叶病毒接种实验结果显示,未转基因植株的发病率为75%,而转基因植株均系统性发病,推测由于HC-Pro的大量表达抑制了甘蔗体内自身的RNA沉默机制而使病情加重。其它农艺性状调查结果显示,转基因与未转基因植株之间不存在显著差异,表明转HC-Pro和PMI基因对甘蔗的生长或其他农艺性状没有负面影响。 相似文献