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为明确小热激蛋白在沙葱萤叶甲Galeruca daurica应对温度胁迫中的作用,采用PCR方法克隆沙葱萤叶甲小热激蛋白基因Hsp20（GdHsp20.6）完整的开放阅读框（open reading frame,ORF）序列,应用在线软件对GdHsp20.6基因进行生物信息学分析,通过原核表达技术诱导表达及纯化其编码蛋白,并通过实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）技术分析不同温度胁迫下GdHsp20.6基因的表达量。结果显示,GdHsp20.6基因ORF序列长度为543 bp,编码180个氨基酸,预测分子量为20.6 kD,无跨膜区和信号肽。GdHsp20.6氨基酸序列有高度保守的α-结构域。GdHsp20.6氨基酸序列与其它鞘翅目昆虫的Hsp20氨基酸序列有较高的一致性,其中与花绒寄甲Dastarcus helophoroides的Hsp20.99氨基酸序列的一致性最高,为63%。GdHsp20.6基因在大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）细胞系中成功表达,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG）诱导后GdHsp20.6蛋白成功表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）和Western-blot分析表明融合蛋白大小与预测大小一致,并纯化获得了纯度较高的目的蛋白GdHsp20.6。低温（-10~5℃）和高温（35~40℃）处理1 h以及处理后25℃恢复30 min均能诱导GdHsp20.6基因表达上调,并且0℃处理30~120 min也能诱导GdHsp20.6基因表达上调。表明GdHsp20.6基因在沙葱萤叶甲应对低温和高温胁迫中可能起着重要作用。 相似文献
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利用杂交瘤单克隆抗体技术制备了AHYT—1和AHl05012株嗜水气单胞菌的菌体单抗，筛选出11个能稳定分泌抗嗜水气单胞菌单克隆抗体的细胞株，并对这些单抗进行了特性分析。经单抗类型测定，这些单抗分属IgM、IgG2a2个亚类，且均具有ELISA反应特性，腹水抗体效价在1：10^4—1：10^6，其中单抗4G4、2H4、GH9具有免疫荧光特性。ELISA特异性分析结果表明，4G4、2H4、FA4、GH9、CF2为嗜水气单胞菌血清型特异性单抗，4G4、2H4识别同一种血清型的嗜水气单胞菌分离株，而FA4、GH9、CF2却识别另外一种血清型的嗜水气单胞菌，并且与其他血清型的嗜水气单胞菌、温和气单胞菌以及鳗弧菌、爱德华氏菌、克鲁氏耶尔森菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌均不反应。Western-blot结果表明，单抗4G4、2H4、FA4所针对的抗原是菌体脂多糖(LPS)，且它们所识别的LPS抗原表位不同。菌体单抗研究结果表明，4G4、2H4和GH93株单抗可应用于嗜水气单胞菌的诊断和血清分型。本研究目的旨为建立一种快速诊断鱼类嗜水气单胞菌病的方法和血清分型方法。 相似文献
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三角帆蚌Rab3 cDNA全长克隆及其原核表达 总被引：2，自引：1，他引：1
根据三角帆蚌消减杂交cDNA文库获得的EST序列,运用cDNA末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends,RACE）技术获得三角帆蚌Rab3基因的全长cDNA序列（GenBank登录号为HQ190954）。序列全长1707 bp,开放阅读框666 bp,编码221个氨基酸,5’端非编码区为158 bp,3’端非编码区为883 bp。软件推测其编码蛋白相对分子量为24.92 KDa。NCBI Blastp进行氨基酸序列同源性分析表明,与居蟹皮海绵（Suberites domuncula）的Rab-3like（SdRab3）氨基酸相似性最高,为64%,构建进化树的结论也是先与居蟹皮海绵的Rab3-like（SdRab3）聚为一支。根据获得的Rab3基因cDNA全长序列,设计特异性引物扩增获得完整开放阅读框序列,并将已克隆到的三角帆蚌Rab3开放阅读框定向插入原核表达载体PQE-His质粒中,转化大肠杆菌BL21（DE3）。在30℃,5 h,1 mM IPTG的诱导条件下,Rab3蛋白得到高效表达,重组菌体经裂解和SDS-PAGE电泳分析,发现一条26 kDa左右特异的蛋白表达条带,其表达量约占菌体总蛋白30%。Western-blot检测表明,在健康组和病变三角帆蚌肝脏中,Rab3蛋白与β-actin的表达量比值分别为0.438和0.580。这一结果说明,Rab3基因在三角帆蚌经病原菌侵染后,表达量上调,且已有研究表明Rab3有通过调节中性粒细胞的胞吐作用来抵抗细菌侵入、防止机体感染的功能,从而初步推测三角帆蚌Rab3蛋白可能与三角帆蚌瘟病有关。 相似文献
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【目的】分析牛乳腺中7种主要乳蛋白基因密码子使用偏好性,筛选高频密码子和低频密码子,依据其对人溶菌酶基因进行密码子局部优化和全局优化,通过牛乳腺上皮细胞等多种细胞对优化效果进行分析评价,为提高重组人溶菌酶表达量,开发新型、高效、安全的重组人溶菌酶提供理论依据。【方法】利用CodonW和EMBOSS等软件对7种主要牛乳蛋白和人溶菌酶基因密码子偏好进行生物信息学分析,筛选牛乳蛋白基因高频、低频密码子并根据牛乳蛋白基因密码子使用偏好对人溶菌酶基因翻译起始区前22位密码子（LYZop22）和全局密码子(LYZop)分别进行优化。构建人溶菌酶-荧光素酶融合表达载体（pGL3-LYZcw/op22/op）和人溶菌酶过表达载体（pcDNA-LYZcw/op22/op）,将上述载体分别转染牛乳腺上皮细胞(BMEC)、牛成纤维细胞（BFFC）和C127小鼠乳腺上皮细胞等3种细胞,通过荧光素酶、实时荧光定量PCR及Western-blot等方法检测密码子优化对溶菌酶表达的影响。【结果】牛乳蛋白基因密码子偏好以GC结尾,GC3s平均含量为0.537±0.062,而人溶菌酶GC3s含量为0.407,偏好以AT结尾;聚类结果表明,牛乳中酪蛋白与乳清蛋白类基因在密码子使用偏好性上也存在一定差异。依据筛选获得的牛主要乳蛋白基因5个高频密码子（RSCU>1.5）和7个低频密码子（RSCU<0.5）对人溶菌酶基因密码子进行优化并转染多种细胞进行表达效果分析。荧光素酶分析发现,相比野生型溶菌酶密码子（LYZcw）,翻译起始区密码子优化类型LYZop22分别在BMEC、BFFC细胞中提高1.48倍（P<0.01）和1.30倍（P>0.05）;而全局密码子优化类型LYZop分别在BMEC、BFFC中提高2.2倍（P<0.01）和2.44倍（P<0.01）,说明密码子优化能明显提高人溶菌酶在多种细胞中表达量。实时荧光定量PCR结果表明,LYZop22相比LYZcw在BMEC和BFFC细胞中分别提高了2.08倍（P<0.05）和1.5倍（P>0.05）,而LYZop则分别提高了22倍（P<0.01）和17.8倍（P<0.01）,mRNA表达水平与密码子优化后的mRNA二级结构稳定性呈正相关。Western-blot结果也进一步表明,密码子优化后的LYZop22和LYZop能明显提高重组人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞中的表达量。上述结果表明,根据牛乳腺中主要乳蛋白基因密码子使用偏好进行密码子优化,能显著提高人溶菌酶在牛乳腺上皮细胞及成纤维细胞中的表达量,且溶菌酶基因全局密码子优化效果优于翻译起始区密码子优化效果。【结论】通过生物信息学分析获得了牛乳蛋白基因使密码子使用偏好及高低频密码子;依据牛乳蛋白密码子使用偏好性对人溶菌酶密码子优化能显著提高重组人溶菌酶mRNA水平和蛋白水平的表达量,为今后利用生物反应器高效生产重组人溶菌酶奠定基础。 相似文献
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采用RT-PCR方法从鸭源呼肠孤病毒DRV—GZ株中扩增出了S2基因片段,将其克隆到表达载体pET-28a（＋）中,测序验证后转化入表达宿主菌Rosetta^TM2（DE3）plysS,进行IPTG诱导表达。结果表明,重组菌可表达出相对分子质量约为50000的重组融合蛋白,在浓度为0．6mmol／L的IPTG诱导4h的情况下表达效果最好。表达的蛋白以包涵体的形式存在于菌体中。表达产物经Ni柱纯化后可得到纯度较高的目的蛋白。经Western-blot分析,所纯化的蛋白能与抗呼肠孤病毒DRV—GZ株阳性血清进行特异性的免疫印迹反应,证实表达的蛋白具有较好的反应原性。 相似文献
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茶树花蕾14-3-3蛋白基因的分子克隆及差异表达分析 总被引：2，自引：0，他引：2
【目的】从分子水平研究茶树花蕾发育阶段的相关基因表达,了解茶树花蕾的发育机理,利用分子生物学技术抑制茶树的生殖生长、促进营养生长。【方法】利用cDNA-AFLP技术对茶树花蕾发育早期和晚期的差异表达进行分析。采用RACE技术克隆到花蕾发育晚期阶段特异表达的、在花蕾发育中可能起重要作用的14-3-3基因,通过RT-PCR和Western-blot方法研究该基因转录水平和蛋白质表达水平的特点。【结果】在测定的大约1 110个茶树花蕾cDNA片段中,122个（10.9%）是差异性表达的,其中87个在发育晚期特异表达,包括茶树14-3-3蛋白基因（GenBank登录号：DQ444463）,其全长为1 072 bp,包含1个由783个核苷酸组成的ORF,编码260个氨基酸,5′非翻译区和3′非翻译区分别有67和222个核苷酸,该基因与其它植物的14-3-3蛋白基因在核苷酸序列和推导的氨基酸序列方面均有着比较高的相似性。RT-PCR和Western-blot分析表明该基因在茶树的晚期发育花蕾中特异表达。【结论】14-3-3蛋白仅存在于茶树发育晚期的花蕾中。cDNA-AFLP技术能用于茶树花蕾不同发育时期的基因分离研究。 相似文献
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将猪传染性胃肠炎病毒的N基因克隆到表达载体pET28a后,转化到BL21(DE3)大肠杆菌表达系统中.通过筛选表达温度和IPTG的浓度,使N基因在原核表达系统中表达并使目的表达产物产量达到最高值.将诱导表达的产物进行SDS-PAGE蛋白电泳和Western检验,证明该表达产物是猪传染性胃肠炎病毒的N蛋白.试验结果说明,猪传染性胃肠炎病毒N基因能够在原核表达系统中大量表达,而且表达的蛋白质具有生物学活性. 相似文献
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瘦素受体（leptin receptor,LEPR）在机体的体质量平衡、造血、生殖、血管生成和免疫过程中发挥着重要作用。为进一步了解LEPR基因在苏钟猪脂肪沉积调控中的作用机制,本研究利用Real-time PCR方法和Western-blot方法分析该基因在12头苏钟猪中5个脂肪易沉积组织（心脏、肝脏、肾脏、背膘和眼肌）RNA和蛋白水平的表达谱信息。结果表明：LEPR的mRNA在这5种组织中均有表达,其在各组织中的mRNA表达丰度表现为：背膘〉眼肌〉心脏〉肝脏〉肾脏,其中在背膘的表达量极显著高于其他几种组织（P〈0.01）;LEPR蛋白在这5种组织中也均有表达,其中在心脏中的表达量最高,显著高于其他组织（P〈0.01）,且在公猪组织的表达量显著高于母猪组织（P〈0.05）;另外,LEPR第18外显子在苏钟猪群中检测到3个高突变率的SNPs。LEPR对苏钟猪的背膘、肌肉、心脏、肾脏、肝脏等组织的脂肪沉积有重要影响,是苏钟猪肉质改良育种中潜在的重要候选基因。 相似文献
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研究采用PCR 方法从焦虫病患牛的全血基因组中扩增得到846 bp 的Tams1 基因片段,将其克隆至真核表达载pcDNA3.1(+),构建Tams1基因的真核表达质粒.经测序验证后, 将Tams1基因的真核表达质粒尾静脉注射小白鼠进行Tams1 基因的瞬时表达.取接种小鼠的肝脏提取总RNA,采用RT-PCR 扩增目的条带;用重组质粒pcDNA3.1(+)-Tams1 皮下注射免疫小白鼠4 次后,进行免疫抗体检测.试验结果表明重组质粒pcDNA3.1(+)- Tams1含有完整的Tmas1基因片段.用该重组质粒免疫小鼠56 d后,小鼠血清中抗重组质粒pcDNA3.1(+)- Tams1的抗体效价可达1∶12 000以上,说明该重组质粒具有很强的抗原性.经Western-blot检验可得到抗原-抗体复合物产生的特异性条带,说明该重组质粒pcDNA3.1(+)- Tams1具有免疫原性. 相似文献
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为筛选豆状囊尾蚴的特异性抗原,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹(Western-blot)技术对自然感染的豆状带绦虫成虫、幼虫的头节、囊壁可溶性抗原及囊液抗原进行了分析.结果表明:从豆状带绦虫不同发育阶段的虫体中分离出5~12条主要蛋白区带,分子质量为25~114ku.以第7周自然感染家兔血清对7种虫体抗原进行的Western-blot分析显示,7种虫体抗原在42、57、63ku处均能被兔抗豆状囊尾蚴血清识别.以家兔阳性血清中提取出来的IgG免疫球蛋白对7种虫体抗原进行的Western-blot分析显示,7种虫体抗原在63ku处均能被兔抗豆状囊尾蚴血清识别.说明63ku蛋白带可作为预防兔豆状囊尾蚴病的候选疫苗抗原.试验初步阐明了豆状带绦虫7种不同抗原的部分生化特性,为对该抗原的进一步深入研究奠定了基础. 相似文献