嗜水气单胞菌外膜蛋白(OMP)在乳酸乳球菌中的表达及其对BALB/c小鼠的免疫保护效果   总被引：1，自引：0，他引：1  

傅罗琴  邓斌  李梅  沈文英  梁权  李卫芬 《农业生物技术学报》2012,20(4):436-442

乳酸球菌(Lactococcus lactis)是一种安全级微生物,为活载体疫苗传递抗原的理想选择.嗜水气单胞菌(A eromonas hydrophila,Ah)能引起鱼类等多种动物的败血病,因其血清型众多,寻找共同保护性抗原是进行疫苗研究的重点.为探究嗜水气单胞菌AS1.927株外膜蛋白(OMP)在乳酸乳球菌中的表达和检测其表达产物对小鼠的免疫保护效果,本研究将己克隆的ompA基因经BamH Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后连接载体pNZ8048,转化乳酸乳球菌NZ9000,nisin诱导表达,并进行SDS-PAGE分析鉴定.结果显示,重组基因工程菌L.lactis[pNZ-ompA]表达的融合蛋白分子量约为36.2 kD,成熟蛋白分子量约为33.7 kD.将重组基因工程菌L.lac tis [pNZ-ompA]口服免疫BALB/c小鼠(Mus musculus),用放射免疫法检测末次免疫一周后的各组小鼠肠粘膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)的水平以及用间接ELISA法检测小鼠血清特异性抗体IgG,结果发现,该重组基因工程菌能显著提高sIgA的分泌(P＜0.05);同时在小鼠血清中的特异性抗体含量也显著高于对照组(P＜0.05).末次免疫两周后用100 LD50的Ah AS 1.927(3.3×105 cfu/mL)腹腔注射攻击小鼠,口服重组菌对小鼠的相对免疫保护力(relative percent survival,RPS)为87.5％,表明重组基因工程菌可诱导小鼠对AhAS1.927产生一定的免疫保护作用.该结果将为开发安全有效的口服基因工程鱼用疫苗提供一定的实验基础.  相似文献   

大鲵致病性嗜水气单胞菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR诊断试剂盒的研制     

余波  ;罗永成  ;马永兵  ;徐景峨  ;周思旋  ;杨莉  ;史开志 《广西农业生物科学》2014,(5):1098-1103

根据GenBank中致病性嗜水气单胞菌特异性的气溶素基因序列,设计1对引物,利用普通PCR技术扩增获得hlyA基因片段,并克隆到pMD-18T载体上作为阳性标准品。通过对SYBR GreenⅠ荧光定量PCR反应条件的优化,建立了快速检测致病性嗜水气单胞菌的SYBR GreenⅠ荧光定量诊断方法,以此为基础研制出试剂盒。试剂盒扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,对非致病性嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、迟缓爱德华菌、柱状黄杆菌均无阳性信号扩增,重复性好,灵敏度可达1.0x101拷贝/uL。结果表明研制的致病性嗜水气单胞菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR试剂盒具有特异、灵敏、快速、重复性好等特点,适合于大鲵临床样品的检测。  相似文献   

嗜水气单胞菌外膜蛋白（OMP）的原核表达及其对BALB/c小鼠的免疫保护研究   总被引：2，自引：0，他引：2  

胡春霞  李梅  李卫芬  许梓荣  沈文英 《农业生物技术学报》2010,18(2):218-224

为确定嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)AS1.927株外膜蛋白(OMP)的原核表达产物是否具有抗原性及其对小鼠的免疫保护力.本研究根据GenBank上嗜水气单胞菌外膜蛋白ompA基因序列(GenBank登录号:AF146597)设计1对引物,克隆出ompA全长基因1020 bp(GenBank登录号:EU309491),经Sal Ⅰ和Xhol Ⅰ双酶切后连接pET-30a(+),转化大肠杆菌(Escherichia cDli)BL21,IPTG诱导表达,并进行SDS-PAGE及Westernblot分析鉴定.结果显示重组基因工程菌E.coli[pET-30a-ompA]表达的融合蛋白分子量约为40.7kD,可以被鼠抗嗜水气单胞菌外膜蛋白抗血清识别.将重组基因工程菌Ecoli[pET-30a-om-pA]口服免疫BALB/c小鼠(Mus mussulus);末次免疫1周后用放射免疫分析小鼠肠粘膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)水平,检测结果揭示,该重组基因工程菌能提高sIgA的分泌(P<0.05);同时在小鼠血清中测出特异性抗体IgG(P<0.05).末次免疫2周后用100 LD50的Ah AS1.927(3.3×105> cfu/mL)腹腔注射攻击小鼠,口服重组菌对小鼠的相对免疫保护力(relative percent survival,RPS)为75%,表明重组基因工程菌可诱导小鼠对AhAS1.927产生一定的免疫保护作用.  相似文献   

嗜水气单胞菌UDP-乙酰葡萄糖胺-4-差向异构酶基因的克隆表达及酶的性质     

龚霞  陆承平  姚火春 《中国水产科学》2008,15(1):106-112

通过水生动物源性嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila,Ah）强毒株J-1株与弱毒株MR-1株抑制差减杂交得到gneJ差减片段,该片段与创伤弧菌（Vibrio vulnificus）和人源嗜水气单胞菌的UDP-乙酰葡萄糖胺-4差向异构酶基因有较高的同源性。扩增完整的gneJ基因,进行分布检测并将其克隆至质粒pET32a（＋）,在大肠杆菌（Escherichia coli）BL21中进行异源表达,SDS-PAGE结果显示,重组表达蛋白的分子量约59．7kD,与理论推测值基本相同。酶活性分析表明,该重组蛋白可将UDP-乙酰葡萄糖胺转化为UDP-乙酰半乳糖胺,确证gneJ基因编码蛋白为UDP-乙酰葡萄糖胺-4-差向异构酶。Western Blot分析显示,嗜水气单胞菌J-1株胞外产物的兔抗血清可识别该重组蛋白,表明该蛋白与天然蛋白有相同的抗原性。以重组蛋白为免疫原,对小鼠进行动物保护实验,结果显示,该重组蛋白对小鼠有60％的保护率,证明UDP-乙酰葡萄糖胺-4差向异构酶可作为亚单位疫苗的侯选成分。  相似文献   

嗜水气单胞菌J-1株OmpA融合蛋白的高效表达及免疫原性分析   总被引：3，自引：0，他引：3  

蒋蔚  刘永杰  陆承平 《中国水产科学》2008,15(2):301-306

以嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）J-1株基因组为模板,根据GenBank已发表的嗜水气单胞菌外膜蛋白的基因序列设计1对引物,扩增去除信号肽序列的成熟外膜蛋白OmpA的基因片段,定向克隆至表达质粒pET32a（＋）中,重组质粒经限制性酶切鉴定后测序。结果表明,插入片段长度为948bp,与NCBI上登录的几个相关序列相比,同源性在93．1％-95％之间,缺失4个氨基酸。将重组原核表达质粒pET32a-OmpA转化至大肠杆菌BL21（DE3）,经诱导可表达分子量约57．4kD的蛋白,凝胶薄层扫描显示OmpA在转化菌中表达量占全菌蛋白的50％以上。用兔抗J-1株总外膜蛋白血清进行Western blot,在57．4kD处有明显反应条带。融合蛋白经Ni-NTA树脂柱亲和层析纯化后免疫新西兰兔制备抗血清,ELISA效价达1：12800以上。Western blot检测结果显示,该血清与9株具有代表性的气单胞菌的分子量约35kD的外膜蛋白均有较强反应,说明所表达的融合蛋白不仅保持原有外膜蛋白的免疫原性,而且提示OmpA可能是嗜水气单胞菌的共同保护性抗原。[中国水产科学,2008,15（2）：301—306]  相似文献   

Effect of dietary Curcuma longa on enzymatic and immunological profiles of rohu,Labeo rohita (Ham.), infected with Aeromonas hydrophila     

Swagatika Sahu  Basanta Kumar Das  Bibhudendu Kumar Mishra  Jyotirmayee Pradhan  Surya Kanta Samal  Niranjan Sarangi 《Aquaculture Research》2008,39(16):1720-1730

The aim of this study was to evaluate the dietary dosages of turmeric that enhance immune response and disease resistance against the opportunistic pathogens Aeromonas hydrophila in Labeo rohita fingerlings. Hence, four different dosages of turmeric at 0.1, 0.5, 1.0 and 5.0 g kg^?1 feed were given to the fingerlings of L. rohita for 60 days at 4% body weight. At every 20‐day interval, different biochemical, haematological, enzymatic and immunological parameters of fish were evaluated. After 60 days, fish were challenged with A. hydrophila. The mortality (%) was recorded on the tenth day post challenge. Most of the immune parameters including lysozyme activity, superoxide anion production and serum bactericidal activity were significantly (P<0.05) higher on 60 days of feeding of 1.0 g of turmeric per kg of feed. Challenge study indicated 100% and 89% survivability in the group of fish fed with 5.0 and 1.0 g of turmeric per kg of feed respectively. Feeding of turmeric might have maintained long‐term protection in fish by elevating the nonspecific immune system such as Nitroblue tetrazolium (NBT), lysozyme and serum bactericidal activity. The result showed that turmeric at a dose of 1.0 g kg^?1 feed for 60 days provided the greatest protection to pathogen challenge.  相似文献   

斑点叉尾鮰对3种致病菌灭活菌苗的免疫应答   总被引：1，自引：1，他引：0  

李惠芳  汪成竹  陈昌福 《华中农业大学学报》2006,25(6):654-658

将经福尔马林灭活的柱状嗜纤维菌(Cytophaga columnaris)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophi-la)和叉尾鮰爱德华菌(Edwardsiella ictaluri)作为免疫原,分别接种斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatusRafinsque)后,通过测定受免鱼的交叉凝集抗体效价、头肾和血液中吞噬细胞的吞噬活性及用A.hydrophila活菌攻毒的方法,探讨了斑点叉尾鮰对3种灭活菌苗的免疫应答状况。试验结果表明,对斑点叉尾鮰经腹腔注射接种3种灭活菌苗能刺激受免鱼产生较强的免疫应答,受免鱼产生了对3种致病菌的特异性凝集抗体和交叉凝集抗体,与未接种菌苗的对照鱼相比,受免鱼头肾和血液中吞噬细胞的吞噬活性明显上升,活菌攻毒的结果也证明了受免斑点叉尾鮰对C.columnaris,A.hydrophila和E.ictaluri产生了不同程度的相对免疫保护率(RPS)。  相似文献   

七彩神仙鱼 BTN1A1 基因克隆及其在嗜水气单胞菌胁迫下的表达分析     

何恺轩  温彬  高建忠  陈再忠 《广东农业科学》2024,51(4):45-53

【目的】克隆七彩神仙鱼（Symphysodon aequifasciatus）嗜乳脂蛋白 1A1（Butyrophilin 1A1, BTN1A1）基因,分析其在病原刺激下的表达模式,为了解七彩神仙鱼 BTN1A1 基因功能提供依据。【方法】利用生物信息学对七彩神仙鱼 2 个 BTN1A1 基因（BTN1A1-1 和 BTN1A1-2）进行结构和进化分析。根据前期获得的七彩神仙鱼皮肤转录组数据,选取 BTN1A1-1 和 BTN1A1-2 基因的 CDS 区设计引物进行克隆。采用 qRT-PCR 分析 BTN1A1 在各组织中的表达及嗜水气单胞菌刺激下的表达模式。【结果】BTN1A1-1 和 BTN1A1-2 的 ORF 序列长度为 894、1 275 bp,分别编码 298、424 个氨基酸。BTN1A1-1 和 BTN1A1-2 蛋白均具有 1 个信号肽、1 个 Ig 结构域、1 个 lg_like 结构域和 1个跨膜结构域的经典结构,BTN1A1-2 还具有 1 个胞质结构域。七彩神仙鱼 BTN1A1-1 与慈鲷科其他鱼类相似性较高,与尼加拉瓜湖始丽鱼（Archocentrus centrarchus）BTNIAI 对应氨基酸序列同源性最高、为 94.14%。但 BTN1A1-2 与其他鱼类发生分离,形成独特分支。BTN1A1-1 和 BTN1A1-2 在七彩神仙鱼各组织中均有表达,但在鳃、肠道、皮肤等与免疫相关的组织中表达量相对较高。七彩神仙鱼 BTN1A1-1 在嗜水气单胞菌胁迫后表达量先显著下降后上升,而 BTN1A1-2 表达量则先显著上升后下降。【结论】七彩神仙鱼 BTN1A1-1 基因相对保守,而 BTN1A1-2 基因在进化上较为特殊。二者在免疫刺激下的差异表达暗示其可能在七彩神仙鱼免疫防御中发生功能分化。  相似文献   

健康家鱼肠道细菌中的嗜水气单胞菌及其胞外酶分布   总被引：8，自引：0，他引：8  

朱晓燕  汤伏生 《湖北农学院学报》1994,14(1):35-39

从健康鲢、鲤、草鱼和团头鲂肠道食物和肠壁样品中分离出１８５株细菌菌株，利用糊精一品红培养基、氧化酶测定法和淀粉酶测定法对其中的嗜水气单胞菌颁作了调查，鉴别出１９株嗜水气单胞菌、对这批菌株进一步进行了蛋白酶、ＣＭＣ酶、滤纸酶和溶血毒素调查，发现肠道嗜水气单胞菌分别产蛋白酶和ＣＭＣ酶，但均不产滤纸酶和溶血毒素。本文结果证明了肠道嗜水气单胞是肠道正常微生物鲜落之一，对鱼体有一定的有利作用。  相似文献   

家养鲤科鱼暴发性传染病的病原研究   总被引：37，自引：6，他引：37  

陈怀青  陆承平 《南京农业大学学报》1991,(4)

从不同地区、不同鱼种的濒死病鱼的实质性脏器中分离到一种革兰氏阴性、有运动力的短杆菌,具有如下特点:氧化酶和V-P反应均呈阳性,发酵葡萄糖产酸、产气,发酵甘露醇、水杨素和阿拉伯糖,不发酵肌醇,鸟氨酸脱羧酶阴性,对新生霉素不敏感。用API-20E系统试剂盒检测,证实其为嗜水气单胞菌。用该菌人工感染健康鱼,可引致与自然发病鱼类似的病症,其半数致死量(LD_(50))为5×10~3个菌。在该菌的培养上清中存在着一种具有溶血活性的毒素。研究证明,家养鲤科鱼暴发性传染病的病原为产毒素的嗜水气单胞菌,该病的准确名称应为嗜水气单胞菌败血症。  相似文献