| 番茄U6启动子的克隆及CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立 |
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| 引用本文： | 蒲艳,刘超,李继洋,阿尔祖古丽·塔什,胡燕,刘晓东.番茄U6启动子的克隆及CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立[J].中国农业科学,2018,51(2):315-326. |
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| 作者姓名： | 蒲艳 刘超 李继洋 阿尔祖古丽·塔什 胡燕 刘晓东 |
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| 作者单位： | 新疆农业大学农学院/新疆农业大学农业生物技术重点实验室，乌鲁木齐 830052 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金（31560534） |
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| 摘 要： | 【目的】从番茄中克隆高效转录的SlU6启动子，构建CRISPR/Cas9基因编辑载体，并在番茄中建立CRISPR/Cas9系统，为番茄功能基因组学和分子育种研究提供技术基础。【方法】采用PCR方法从‘中蔬四号’番茄品种中克隆4种SlU6启动子，利用Transfer PCR方法分别对4个启动子进行两种不同长度的截短，分别构建8个截短的SlU6启动子驱动GUS的植物融合表达载体。利用农杆菌瞬时转化法分别转染番茄叶片，通过GUS染色筛选出在番茄叶片中转录活性较高的SlU6-2启动子。采用DNA重组技术构建以SlU6-2为启动子驱动sgRNA，以番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体。载体构建成功后，采用PEG法转化番茄原生质体，提取基因组DNA，采用酶切/PCR法分析内源基因突变情况；采用测序法分析内源基因突变的类型。利用突变位点频率分布图来验证番茄内源启动子在番茄CRISPR/Cas9系统中的有效性。【结果】经过两轮PCR，共获得4种8个不同长度的番茄U6启动子，其长度分别是452、202、448、206、433、190、448和218 bp，启动子序列比对分析发现番茄U6启动子与拟南芥U6启动子一样，也含有比较保守的两个元件，USE和TATA框。成功构建了8个SlU6启动子分别驱动GUS的植物融合表达载体。番茄叶片染色结果显示转化后的番茄叶片均被染成蓝色，表明克隆的番茄8个SlU6启动子均具有转录活性。选择SlU6-2P4为启动子驱动sgRNA，成功构建番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体，验证结果表明番茄内源启动子SlU6-2P4能有效地驱动sgRNA的转录，并成功实现对番茄内源基因的编辑。内源基因突变的类型都为碱基替换，突变热点仅存在于内源基因靶序列区。【结论】成功克隆了4种在番茄叶片中高效转录的SlU6启动子；基于SlU6-2启动子的CRISPR/Cas9基因组编辑载体，在番茄中成功实现对内源基因的编辑。
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| 关 键 词： | CRISPR/Cas9 SlU6启动子 克隆 番茄 基因编辑 |
| 收稿时间： | 2017-06-21 |
Different SlU6 Promoters Cloning and Establishment of CRISPR/Cas9 Mediated Gene Editing System in Tomato |
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| PU Yan,LIU Chao,LI Ji-Yang,AERZU GULI·TaShi,HU Yan,LIU XiaoDong.Different SlU6 Promoters Cloning and Establishment of CRISPR/Cas9 Mediated Gene Editing System in Tomato[J].Scientia Agricultura Sinica,2018,51(2):315-326. |
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| Authors: | PU Yan LIU Chao LI Ji-Yang AERZU GULI·TaShi HU Yan LIU XiaoDong |
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| Institution: | College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University/Laboratory of Agricultural Biotechnology of Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052 |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | CRISPR/Cas9 SlU6 promoter clone tomato gene editing |
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