| 虾虹彩病毒TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测方法的建立 |
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| 引用本文： | 韦信贤,陈孝宇,贾鹏,王瑞,谭红连,杨慧赞,童桂香,黄光华.虾虹彩病毒TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测方法的建立[J].南方农业学报,2020,51(2):404-411. |
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| 作者姓名： | 韦信贤 陈孝宇 贾鹏 王瑞 谭红连 杨慧赞 童桂香 黄光华 |
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| 作者单位： | 广西水产科学研究院/广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室,南宁,530021武汉海关技术中心,武汉,430050深圳海关/国家水生动物疫病监测重点实验室,广东深圳,518045 |
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| 摘 要： | 目的]建立检测虾虹彩病毒(SIV)的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR,为实现虾虹彩病毒病(SIVD)快速诊断及疫情监测提供一种新的技术手段.方法]根据SIV的MCP基因保守序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,将目的片段克隆至pMD18-T载体制备重组质粒pMD18-T-MCPSIV;优化反应体系及扩增条件后建立检测SIV的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR,以pMD18-T-MCPSIV为标准品绘制标准曲线,并通过特异性、敏感性、重复性试验及临床应用验证其实用性.结果]制备的重组质粒(pMD18-T-MCPSIV)DNA稳定性好,满足作为标准品的要求;标准品起始模板范围为2.0×101~2.0×109拷贝/反应时,建立的标准曲线具有良好线性关系.优化后的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR灵敏度高,对重组质粒的检测灵敏度可达20拷贝/反应,对虾组织SIV的检测灵敏度约10拷贝/mg,其临床检测的敏感性与套式PCR相当;与虾类其他常见病原无交叉反应,组内和组间变异系数分别为0.27%~0.54%和0.61%~0.95%,且扩增与产物分析同步完成,整个检测过程仅需1 h左右.采用建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR与目前农业农村部推荐的套式PCR同时对276份临床虾样品进行SIV检测,结果显示,两种方法的大部分检测结果一致,符合率为98.6%,但检测低拷贝数样品时前者具有更高的灵敏度.2018和2019年广西虾样品的SIV阳性检出率分别为19.7%和7.5%,且养殖凡纳滨对虾、罗氏沼虾和红螯螯虾均检测到SIV阳性.结论]基于SIV MCP基因保守序列建立的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR检测方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好、定量范围宽及简单快速等优点,适用于虾类样品SIV检测,可为SIVD快速诊断及疫情监测提供一种新的技术手段.
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| 关 键 词： | 虾虹彩病毒(SIV) MCP基因 TaqMan-MGB探针 荧光定量PCR 套式PCR |
Development of TaqMan-MGB probe fluorescence quantitative PCR for detection of shrimp iridescent virus |
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| WEI Xin-xian,CHEN Xiao-yu,JIA Peng,WANG Rui,TAN Hong-lian,YANG Hui-zan,TONG Gui-xiang,HUANG Guang-hua.Development of TaqMan-MGB probe fluorescence quantitative PCR for detection of shrimp iridescent virus[J].Journal of Southern Agriculture,2020,51(2):404-411. |
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| Authors: | WEI Xin-xian CHEN Xiao-yu JIA Peng WANG Rui TAN Hong-lian YANG Hui-zan TONG Gui-xiang HUANG Guang-hua |
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