| 摘 要： | 【目的】以楸树胚性愈伤组织为受体,建立有效的楸树遗传转化体系,为今后楸树性状的遗传改良奠定基础。【方法】通过农杆菌EHA105介导以胚性愈伤组织作为外植体进行遗传转化,通过正交试验获得最优的遗传转化条件,进而将外源基因转入到楸树基因组中。【结果】在1/2 MS培养基中添加不同梯度浓度的卡那霉素(Kana)进行选择压力筛选,在添加了60 mg·L~(-1)Kana的1/2 MS培养基中,楸树胚性愈伤组织的分化率为0.00%,存活率仅为5.71%,因此确定60 mg·L~(-1)为遗传转化的选择压。采用正交设计L18(37)进行农杆菌介导的楸树遗传转化试验,通过GUS化学组织染色统计瞬时表达率,正交试验直观分析和单因素方差分析结果表明:在预培养时间为2天,采用农杆菌菌株EHA105、菌液浓度OD600值为0.7、添加乙酰丁香酮(AS)浓度为300μmol·L~(-1)、侵染时间为10 min,共培养时间为5天的条件下,农杆菌介导的转化效率最高,且对转化效率影响最大的2个因素是乙酰丁香酮浓度和预培养时间。对浸染后的胚性愈伤组织进行8个月的筛选培养,共获得32个抗性组织团,对其中15个增殖较多的抗性愈伤组织进行PCR检测,表明86.67%的抗性组织团中有外源基因整合到楸树基因组中。内源激素水平会对植物体细胞胚分化产生影响,细胞分裂素(CTK)和脱落酸(ABA)促进体胚发生,生长素(IAA)和赤霉素(GA)对体胚发生有抑制作用。通过测定内源激素可知,转基因的抗性组织中内源CTK和ABA水平显著低于野生型的楸树胚性愈伤组织,而内源IAA和GA则显著高于野生型胚性愈伤组织,推测内源激素水平可能是转基因抗性组织体胚分化能力比较差的原因。【结论】建立了农杆菌介导的楸树胚性愈伤组织的遗传转化体系,对筛选获得的15个抗性愈伤组织进行PCR检测,其中13个抗性愈伤组织中有外源基因的整合。内源激素水平的变化可能是导致楸树转基因抗性愈伤组织难以分化的原因。
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