| 摘 要： | 【目的】分析猪FAM213B基因启动子转录活性区域,并检测转录因子NFκB对启动子活性及猪FAM213B基因表达影响,为深入了解FAM213B基因的转录调控机制影响前列腺素合成、母猪妊娠等繁殖活动奠定基础。【方法】采集卵泡期子宫,分离子宫内膜上皮组织,经胶原酶方法获得猪原代子宫内膜细胞,用于猪FAM213B基因启动子活性检测。参照笔者所在课题组前期研究获得的猪FAM213B基因m RNA全序列(Gen Bank登录号:KX444503)以及5￠调控区序列(Gen Bank登录号:100134955),通过PCR扩增猪FAM213B基因较长启动子序列,并进行测序鉴定;在此基础上,PCR扩增带有Mlu I和Xho I限制性酶切位点的FAM213B基因启动子7个5'端缺失片段,并通过双荧光素酶报告基因载体系统构建猪FAM213B基因启动子7个不同的5'端缺失载体。将7个载体经无内毒素处理后与p RL-TK质粒用阳离子脂质体法一起转染猪子宫内膜细胞,用双荧光素酶报告基因系统进行Luciferase活性检测,比较各启动子片段转录活性。生物信息学分析FAM213B基因启动子潜在转录因子结合位点,通过Ch IP试验验证FAM213B基因启动子与潜在转录因子NFκB的相互作用。构建NFκB1和Rel A的超表达载体,化学合成NFκB1和Rel A的干扰si RNA片段,分别转染猪子宫内膜细胞,通过双荧光素酶报告基因系统进行Luciferase活性检测和荧光定量PCR分别检测超表达和干扰表达NFκB1和Rel A对猪FAM213B基因启动子活性和m RNA表达影响。【结果】PCR和测序获得猪FAM213B基因启动子长度为2 261bp(-2178/+83)。生物信息学预测结果表明猪FAM213B基因启动子区存在潜在的CREB、CCAAT增强子结合蛋白、E-box因子的结合位点,炎性因子NFκB潜在结合位点分别位于-1143/-1132和-664/-655区间。启动子报告基因活性检测结果表明:重组载体P2(-1352/+30)荧光活性最高,极显著高于P1(-1 760/+30)(P0.01),在-1 760/-1 352区域存在负调控元件;而P2显著高于P3(-919/+30)(P0.05),表明在-1352/-919区域存在正调控元件;P3(-919/+30)活性极显著高于P4(-604/+80)(P0.01),表明在-919/-604区域存在正调控元件;P4、P5、P6和P7活性差异不显著,-1352/-919区域为核心启动子区,-1352/-604对于维持该启动子较高转录活性起着重要的作用。Ch IP结果表明启动子区-1143/-1132存在NFκB1结合位点,-664/-655存在Rel A结合位点。超表达载体pc DNA3.1-NFκB1与P2(-1352/+30)启动子片段重组载体共转染猪子宫内膜细胞后,P2启动子活性极显著高于对照组(P0.01),pc DNA3.1-NFκB1载体单独转染猪子宫内膜细胞后FAM213B基因m RNA表达量显著高于对照组(P0.05);超表达载体pc DNA3.1-Rel A与P3(-919/+30)启动子片段重组体共转染猪子宫内膜细胞,P3启动子活性极显著低于对照组(P0.05),pc DNA3.1-Rel A载体单独转染猪子宫内膜细胞后,FAM213B基因的mRNA表达量显著低于对照组。转染NFκB1和Rel A的si RNA片段干扰片段,FAM213B基因启动子活性和m RNA表达量则表现与超表达相反的结果。【结论】获得了猪FAM213B基因启动子核心启动子序列为-1352/-919区域,NFκB是FAM213B基因启动子的转录因子,NFκB成员NFκB1和Rel A在猪子宫内膜细胞中对FAM213B基因的表达起调控作用。
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