Preparation and comparison of biological properties of recombinant carp (Cyprinus carpio) growth hormone and its Cys-123 to Ala mutant |
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| Authors: | Mira Fine Edna Sakal Dorit Vashdi Nava Chapnik-Cohen Violet Daniel Avigdor Levanon Orli Lipshitz Arieh Gertler |
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| Institution: | (1) Department of Biochemistry, Food Science and Nutrition, The Faculty of Agriculture, The Hebrew University of Jerusalem, Rehovot, 76100;(2) Department of Biochemistry, The Weizmann Institute of Science, Rehovot, 76100;(3) Biotechnology General (Israel), Rehovot, 76326, Israel |
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| Abstract: | Carp growth hormone (cGH) cDNA, in which Cys-123 was mutated to Ala, was prepared, transferred to the expression vector, expressed
in Escherichia coli and the mutant was purified to homogeneity. The mutation only slightly improved yield of the monomeric fraction, indicating
that Cys-123 is not involved in improper refolding. As compared to cGH, the mutant (cGH-C123A) exhibited lower binding affinity
toward homologous liver receptors and lower bioactivity in a 3T3-F442A preadipocyte bioassay despite the fact that both hormones
exhibited almost identical cross-reactivity with anti-cGH antibodies. These results, along with those of a structural comparison
to hGH, suggest that Cys-123 is located in the hydrophobic core of the hormone, and is most likely affecting the conformation
of the binding site. Dimeric forms of the hormone and its mutant were less active than their respective monomers. Homologous
binding experiments using a carp liver microsomal fraction revealed a single receptor population with Kd = 0.77 nM and Bmax = 241 fmol/mg microsomal protein.
Résumé Un ADN complémentaire (cDNA) de l'hormone de croissance de carpe (cGH), dans lequel l'acide aminé Cys-123 a été muté en Ala,
a été préparé, inséré dans un vecteur d'expression, et exprimé dans Escherichia coli. Le mutant a ensuite été purifié jusqu'à homogénéité. La mutation améliore seulement faiblement la production de la fraction
monomérique, indiquant que le Cys-123 n'est pas impliqué dans un repliement erroné. Comparé à la cGH, sa forme mutée (cGH-C123A)
montre une plus faible affinité de liaison vis à vis de récepteurs hépatiques homologues, et une plus faible activité biologique
dans un test réalisé sur des préadipocytes 3T3-F442A; cela en dépit du fait que les deux hormones présentent des réactions
croisées presque identiques avec un anticorps anti-cGH polyclonale. Ces résultats, associés à une comparaison à la structure
de l'hGH, suggèrent que le Cys-123 est localisé dans la partie hydrophobique de l'hormone, et affecte, le plus vraisemblablement,
la conformation du site de liaison. Les formes dimériques de l'hormone et de sa forme mutée sont moins actives que leurs monomères
respectifs. Les études de liaison homologue, réalisées avec des fractions microsomales de foie, révèlent une population unique
de récepteurs de Kd = 0,77 nM et de Bmax = 241 fmol/mg de proteine microsomale.
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| Keywords: | Cyprinus carpio recombinant growth hormone receptor GH RIA site-directed mutagenesis 3T3-F442A praedipocytes bioassay |
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