| 绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)丙酮酸脱氢酶E1-α亚单位基因(pdha)的克隆、表达及其免疫学活性测定 |
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| 引用本文： | 许健,储岳峰,高鹏程,赵萍,贺英,剡根强,逯忠新.绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)丙酮酸脱氢酶E1-α亚单位基因(pdha)的克隆、表达及其免疫学活性测定[J].农业生物技术学报,2012,20(3):275-282. |
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| 作者姓名： | 许健 储岳峰 高鹏程 赵萍 贺英 剡根强 逯忠新 |
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| 作者单位： | 1. 中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部草食动物疫病重点开放实验室,甘肃省生物检测工程技术研究中心,兰州 730046;石河子大学动物科技学院,石河子 832000
2. 中国农业科学院兰州兽医研究所,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部草食动物疫病重点开放实验室,甘肃省生物检测工程技术研究中心,兰州 730046
3. 石河子大学动物科技学院,石河子,832000 |
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| 基金项目： | 甘肃省科技支撑计划项目(No.1011NKCA054);甘肃省农业生物技术专项(No.GNSW-2010-09);国家科技基础性工作专项(No.2008FY210200);国家现代肉羊产业技术体系(No.CARS-39) |
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| 摘 要： | 丙酮酸脱氢酶α-亚单位(PDHA)在病原体丙酮酸脱氢酶的催化过程中发挥着重要作用。为表达绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)PDHA蛋白并测定其免疫学活性,应用PCR方法扩增出绵羊肺炎支原体pdha基因并对其序列进行分析,将pdha基因中色氨酸密码子TGA优化为TGG后进行全基因合成,插入到pET32-a(+)载体上,构建了pET32-a(+)-pdha重组质粒,将重组质粒转化到大肠杆菌(Escherichia coli)BL21中诱导表达PDHA蛋白,并通过免疫印迹及小鼠(Mus musculus)免疫试验对其免疫学活性进行测定。结果pdha基因全长1125bp,编码375aa,(G+C)%为34.76%,第304~306位、379~381位、586~588位、592~594位、625~627位、811~813位、889~891位及964~966位TGA在支原体中编码色氨酸而不是作为终止密码子;基因序列比对及进化树分析显示,绵羊肺炎支原体pdha基因与10种支原体的pdha基因序列同源性为32.6%~85.3%,氨基酸序列同源性为39.3%~90.6%,基因序列和氨基酸序列均与猪肺炎支原体(M.hyopneumoniae)有同源性,分别为85.3%和90.6%;绵羊肺炎支原体pdha基因在33℃、IPTG0.25mmol/L诱导6h的表达条件下,表达量最高;重组的PDHA蛋白可与绵羊肺炎支原体高免血清具有免疫印迹条带,在免疫小鼠后血清抗体效价与对照组相比,均显著升高(P<0.05)。本实验首次成功克隆表达了绵羊肺炎支原体pdha基因,并证明其重组PDHA蛋白具有较好的免疫学活性。为绵羊支原体肺炎基因工程疫苗及诊断研究提供候选靶标。
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| 关 键 词： | 绵羊肺炎支原体 pdha基因克隆 PDHA蛋白表达 免疫学活性 |
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