| 利用CRISPR/Cas9技术敲除RNA甲基化酶TRDMT1基因及其功能初探 |
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| 引用本文： | 徐慧,孙振,薛松磊,豆春峰,胡序明,崔恒宓.利用CRISPR/Cas9技术敲除RNA甲基化酶TRDMT1基因及其功能初探[J].扬州大学学报(农业与生命科学版),2018(2). |
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| 作者姓名： | 徐慧 孙振 薛松磊 豆春峰 胡序明 崔恒宓 |
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| 作者单位： | 扬州大学动物科学与技术学院/表观遗传学及表观基因组学研究所;扬州大学教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室 |
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| 摘 要： | 为构建TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系,利用CRISPR/Cas9系统在TRDMT1基因第1个外显子前插入BGH Ploy(A)转录终止序列,终止TRDMT1基因表达。利用重叠PCR方法合成sgRNA序列,构建TRDMT1-gRNA载体及含不同抗生素基因的同源重组载体TRDMT1-LOXN-Puro和TRDMT1-LOXP-Neo;将同源重组载体TRDMT1-LOXN-Puro、TRDMT1-LOXP-Neo及TRDMT1-gRNA、Cas9表达载体MLM3613共转染HEK293细胞;利用Puromycin和Neomycin抗生素筛选细胞,通过RT-qPCR检测TRDMT1基因转录终止效率。通过细胞生长曲线和划痕试验检测TRDMT1基因敲除对HEK293细胞增殖和迁移能力的影响。结果表明:成功构建了TRDMT1-gRNA载体及TRDMT1-LOXN-Puro、TRDMT1-LOXP-Neo同源重组载体;与正常HEK293细胞相比,试验组TRDMT1表达量仅为1%;TRDMT1基因敲除后显著影响HEK293细胞增殖和迁移。这一研究通过CRISPR/Cas9技术成功构建了TRDMT1基因敲除的HEK293细胞系(HEK293-TKO),为RNA甲基化研究提供了一种有效的工具;TRDMT1基因可能与细胞的增殖和迁移有关。
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