| 摘 要： | 【目的】探索动物机体遭受低温应激及细胞冷冻过程中胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor, IGF-1)与RNA结合基序蛋白3(RNA-binding motif protein 3, RBM3)之间的作用关系,及IGF-1参与哺乳动物细胞抑制低温损伤的机制。【方法】体外培养牦牛卵丘细胞,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)、蛋白免疫印迹(Western blot, WB)和免疫荧光技术检测不同浓度(0、50、100、200ng·mL~(-1))IGF-1和低温应激(30℃、25℃)对RBM3表达影响。卵丘细胞经最佳浓度IGF-1(100 ng·mL~(-1))和对照组(0IGF-1)作用30 h后,低温(30℃、25℃)应激8 h,比较RBM3表达水平。评估在低温应激组、100 ng·m L~(-1) IGF-1处理组和100 ng·mL~(-1) IGF-1+RBM3抑制剂处理组,卵丘细胞25℃应激8 h后凋亡水平差异,并从基因和蛋白水平检测3组卵丘细胞中凋亡相关基因Bax和Bcl-2的表达水平。【结果】(1) IGF-1作用卵丘细胞后RBM3基因和蛋白的表达水平显著上升(P0.05),其在100 ng·mL~(-1) IGF-1处理组最高,免疫荧光检测显示100和200 ng·mL~(-1) IGF-1处理组卵丘细胞胞核和细胞质均可检测到RBM3,而0和50 ng·mL~(-1)处理组,RBM3仅定位在细胞质。(2)卵丘细胞经受低温应激时,RBM3的表达水平显著增加,但其在30℃和25℃应激处理组差异不显著;100 ng·m L~(-1) IGF-1作用卵丘细胞30 h后,其再次接受25℃、8 h低温应激,卵丘细胞中RBM3的表达水平显著高于低温应激前未经IGF-1处理卵丘细胞中RBM3的表达水平,且该处理组卵丘细胞胞质和胞核均可检测到RBM3。(3) 25℃应激后,100 ng·mL~(-1)IGF-1处理组卵丘细胞的凋亡率为(15.94±2.03)%,显著低于其在未经IGF-1处理组和100 ng·mL~(-1) IGF-1+RBM3抑制剂处理组中卵丘细胞的凋亡率,两者分别为(25.86±1.09)%和(20.14±2.65)%,在100 ng·mL~(-1) IGF-1处理组Bcl-2的表达水平显著高于其余两个处理组(P0.05),而Bax的表达水平显著低于其余两个处理组(P0.05)。【结论】RBM3参与牦牛卵丘细胞低温应激调控,IGF-1可调控其在低温应激中的表达水平,从而降低低温诱导的卵丘细胞凋亡。本研究为揭示IGF-1和RBM3参与动物机体或细胞免受低温损伤的分子机制提供了关键信息,为体细胞和生殖细胞冷冻技术的提高提供了理论依据。
|
