| 摘 要： | 【背景】近些年兴起的CRISPR-Cas9基因编辑技术在多种植物中实现了高效的基因打靶,为基因功能研究提供了一种高效快速的方法,但一些CRISPR-Cas9载体编辑效率很低。【目的】通过构建一种由RIBOSOMAL PROTEIN S5 A(RPS5A)启动子启动Cas9并带有红色荧光蛋白筛选标记的CRISPR-Cas9载体,提高拟南芥CRISPR-Cas9编辑效率,并利用这套系统对拟南芥木葡聚糖内糖基转移/水解酶基因TOUCH4(TCH4)进行编辑。【方法】在pKSE401载体的基础上,以从胚胎发育早期就表现出高转录活性的RPS5A启动子替换35S启动子、以DsRed2替换潮霉素抗性基因,构建拟南芥中使用的CRISPR载体pRSE-WH;以AtTCH4为靶基因,使用CRISPR-P2.0(http://crispr.hzau.edu.cn)设计靶位点,将所设计的靶点序列在拟南芥参考基因组中比对分析以排除非特异性靶位点,最终筛选出2个靶位点target 1和target 2。化学合成带有接头的靶位点寡核苷酸序列,退火后分别与pRSE-WH载体连接,构建TCR1和TCR2表达载体,采用农杆菌介导的沾花法侵染野生型拟南芥Col-0,以红色荧光蛋白为标记筛选获得T1代转基因阳性植株。通过靶位点扩增测序法判断T1代转基因植株在预期靶位点是否发生编辑,根据测序结果的峰图对编辑情况进行解码,进一步分析突变类型及基因型。【结果】构建了一个在拟南芥中高效编辑的CRISPR载体pRSE-WH。TCR1和TCR2成功地实现了对TCH4的定点编辑,靶点一的编辑效率为80%,靶点二的编辑效率为100%,总编辑效率为86%。根据测序结果的峰图解码了T1代植株的突变结果,纯合编辑、杂合编辑、双等位编辑均有出现。对不同的编辑类型进行统计发现,59株T1代阳性植株中,无编辑8株,占比13.56%,纯合编辑9株,占比15.25%,双等位编辑40株,占比67.80%,杂合编辑2株,占比3.39%。在T1代发生纯合编辑以及双等位编辑的株系中选择了无红光种子进行繁种,并对T2代植株编辑情况进行测序检测,结果发现T1代中的突变成功遗传到了T2代无Cas9株系中。【结论】pRSE-WH在拟南芥中展现了极高的编辑效率,并且通过对种子进行红色荧光筛选,能够简便地获得无Cas9且稳定遗传的T3代突变体。
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