| 摘 要： | 为了加强对杜仲资源的有效保护和可持续利用,了解杜仲的遗传背景,我们基于杜仲雌雄株转录组数据库开发SSR标记,能够应用于杜仲的功能基因发掘、分子标记辅助育种、遗传多样性分析、遗传图谱构建等研究。基于杜仲雌雄株转录组数据库Unigenes序列,利用MISA软件进行SSRs序列查找及其特征分析;根据微卫星的两翼序列设计引物,以1份随机挑选的杜仲基因组DNA为PCR扩增模板,采用L9(34)正交试验设计优化SSR-PCR反应体系,检验引物扩增效果和各引物扩增条件,进一步以10份不同来源的杜仲DNA为模板检测扩增引物的有效性。发掘了74 230个SSR位点,分布在61 629条Unigenes中,占总Unigenes 33.99%,其中,12~24 bp长度的重复基序最多,基序重复次数以11~15次居多;重复基序种类主要以一、二、三重复基元类型为主,占98.6%,其中出现最多的3种重复类型分别为:A/T(73.16%)、AG/CT(10.91%)、AAG/CTT(1.14%)。采用L9(34)正交试验获得的最优SSR-PCR体系为:20μL体系中含2×Premix Taq酶(0.05μmol·min-1·μL-1)10μL、DNA模板(25 ng/μL)1μL,引物(10μmol/L)0.5μL,以dd H2O补足。从210对引物中筛选获得140对引物,成功用于杜仲基因组PCR的有效扩增,占66.66%,进一步以9个地区的10份杜仲资源,检验上述引物多态性,最终获得15个稳定、可重复的多态性SSR位点,上述位点共检测到57个等位基因,平均每个位点包含3.8个等位基因,杂合度(Ho)为0~1.0,期望杂合度(He)为0.28~0.78,多态信息量(PIC)为0.26~0.70,平均值为0.44。经测序验证,该15个SSR位点都含有预期的重复基序序列。杜仲雌雄株转录组序列中含有高频率的SSR位点,以期开发获得的多态性SSR标记能够应用于杜仲不同种群间的遗传结构和遗传多样性分析,为杜仲的合理保护提供科学依据。
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