| 猪δ冠状病毒N蛋白的原核表达和间接ELISA检测方法的建立 |
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| 引用本文： | 闫瑞杰,张云飞,刘玲玲,等.猪δ冠状病毒N蛋白的原核表达和间接ELISA检测方法的建立[J].西北农林科技大学学报(社会科学版),2019,47(10):1-8. |
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| 作者姓名： | 闫瑞杰 张云飞 刘玲玲 等 |
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| 作者单位： | 河南农业大学牧医工程学院 |
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| 基金项目： | 国家重点研发计划项目（2016YFD0500102）；国家自然科学基金项目（31772773）；河南省科技开放合作项目（15210-6000047） |
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| 摘 要： | 【目的】制备猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)N蛋白及其多克隆抗体,建立检测PDCoV N蛋白抗体的间接ELISA方法。【方法】从PDCoV CH-01毒株中扩增N全基因,克隆至原核表达载体pET-28a中,构建重组表达质粒pET-28a-PDCoV-N,转入BL21(DE3),用IPTG诱导表达重组N蛋白,并对该蛋白的反应原性进行鉴定。诱导表达的N蛋白经镍柱纯化后免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。同时用镍柱纯化后的N蛋白作为包被抗原,建立PDCoV的间接ELISA检测方法,对该方法的特异性、重复性和稳定性进行检测,并利用该方法对河南部分地区猪场送检的165份临床猪血清样本进行PDCoV抗体检测。【结果】成功克隆了1 026 bp的N基因,构建了重组表达载体pET-28a-PDCoV-N,经诱导表达后获得了重组N蛋白,其相对分子质量约42.9 ku,Western blot分析表明所表达的蛋白可与抗PDCoV全病毒猪阳性血清发生反应。制备的PDCoV N蛋白多克隆抗体经Western blot检测表明,该抗体具有特异性;间接免疫荧光试验测定该多克隆抗体在ST细胞上的最佳使用稀释度为1∶200。以N蛋白作为包被抗原建立了间接ELISA方法,确定最佳的反应条件如下:抗原2μg/mL在4℃过夜包被,10 g/L BSA在37℃下封闭2 h,血清(1∶80稀释)37℃孵育1 h,酶标二抗(1∶6 000稀释)37℃孵育1 h,TMB在37℃下显色15 min;待检血清OD_(450)值≥0.272判定为阳性。特异性试验结果显示,该包被抗原与其他猪常见病毒的阳性血清均无交叉反应,批内和批间重复试验变异系数均小于5%。用间接ELISA法对来自河南不同地区的165份血清样本进行检测,结果表明各地样本PDCoV抗体阳性率平均为53.94%。【结论】成功表达了PDCoV N蛋白,制备了其多克隆抗体,建立了PDCoV间接ELISA检测方法,该方法具有良好的特异性、重复性和稳定性,可用于临床猪血清中PDCoV抗体的检测。
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| 关 键 词： | 猪δ冠状病毒 N蛋白 原核表达 多克隆抗体 血清学检测 |
| 收稿时间： | 2018/8/6 0:00:00 |
Prokaryotic expression of N protein and establishment of an indirect ELISA for antibody detection of porcine deltacoronaviru |
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| YAN Ruijie,ZHANG Yunfei and LIU Lingling,et al.Prokaryotic expression of N protein and establishment of an indirect ELISA for antibody detection of porcine deltacoronaviru[J].Journal of Northwest Sci-Tech Univ of Agr and,2019,47(10):1-8. |
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| Authors: | YAN Ruijie ZHANG Yunfei and LIU Lingling |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | porcine deltacoronavirus N protein prokaryotic expression polyclonal antibody serological detection |
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