| 4种楠木AFLP反应体系优化建立 |
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| 引用本文： | 周生财,黄华宏,童再康,吴小林.4种楠木AFLP反应体系优化建立[J].浙江农林大学学报,2013,30(5):789-796. |
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| 作者姓名： | 周生财 黄华宏 童再康 吴小林 |
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| 作者单位： | 1.浙江农林大学 亚热带森林培育国家重点实验室培育基地，浙江 临安 311300;2.浙江省庆元县实验林场，浙江 庆元 323800 |
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| 基金项目： | 浙江省重大科技攻关项目（2012C12908-4） |
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| 摘 要： | 采用核酸电泳缓冲液（TNE）结合十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）提取的高质量楠木Phoebe基因组脱氧核糖核苷酸（DNA）可满足扩增片段长度多态性（AFLP）分析的要求。利用浙江楠Phoebe chekiangensis基因组DNA优化建立楠木AFLP反应体系如下:酶切反应300 ng基因组DNA，0.3 L缓冲液4，0.3 L牛血清白蛋白（100 BSA），50 nkat EcoR，25 nkat Mse，双蒸水加至30.0 L放置37 ℃恒温箱酶切4 h，聚合酶链式反应（PCR）仪上65 ℃15 min；连接反应20.0 L酶切产物，2.5 L T4缓冲液，666.8 nkat T4 连接酶，5 pmol EcoR接头，10 pmol Mse接头，双蒸水加至25.0 L，16 ℃连接过夜（10 ~14 h）；预扩增反应2.0 L连接产物，2.0 L 10 缓冲液，31.25 nmol镁离子，16.67 nkat TaqDNA聚合酶，4 pmol脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP），预扩增引物（E＋A，M＋C）各6 pmol，双蒸水加至20.0 L；选扩增反应稀释40倍的预扩产物2.0 L，2.0 L 10缓冲液，31.25 nmol镁离子，4 pmol dNTP，16.67 nkat TaqDNA聚合酶，选扩增引物（M＋CNN）15 pmol，选扩增引物（E+ANN）12 pmol，双蒸水加至20.0 L。利用上面体系在64对选扩引物中筛出13对适于浙江楠AFLP分析的最佳引物组合。图5表3参24
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| 关 键 词： | 林木育种学 浙江楠 紫楠 桢楠 闽楠 DNA提取 AFLP |
| 收稿时间： | 2012-10-08 |
Optimization of an AFLP protocol with four Phoebe species |
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| ZHOU Shengcai,HUANG Huahong,TONG Zaikang,WU Xiaolin.Optimization of an AFLP protocol with four Phoebe species[J].Journal of Zhejiang A&F University,2013,30(5):789-796. |
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| Authors: | ZHOU Shengcai HUANG Huahong TONG Zaikang WU Xiaolin |
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| Institution: | 1.The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture，Zhejiang A & F University，Lin’an 311300，Zhejiang，China;2.Experimental Forest Farm of Qingyuan County，Qingyuan 323800，Zhejiang，China |
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| Abstract: | To meet the needs of an amplified-fragment-length-polymorphism（AFLP） protocol，high quality genome DNA was extracted from Phoebe chekiangensis，Phoebe sheareri，Phoebe zhennan，and Phoebe bournei seedlings with improved cetyltrimethylammonium bromide（CTAB）methods. For optimization of restriction system（30.0 L），the genome DNA，300 ng；was buffered with 0.3 L；bovine serum albumin （BSA），0.3 L；EcoR，50 nkat；and Mse，25 nkat；and incubated at 37 C for 4 h；then the restriction enzyme was killed with 65 C for 15 min. The best ligation system（25.0 L） was with 20.0 L of the digestion products；T4 buffer，2.5 L；T4 ligase，666.8 nkat；EcoR adapter，5 pmol；and Mse adapter, 10 pmol；and left at 16 C overnight （10-14 h）. The optimal preamplification system （20.0 L） included 2.0 L ligation products；10 buffer，2.0 L；Mg2+，31.25 nmol；Taq DNA polymerase；16.67 nkat；dNTP，4 pmol； pre-amplification primers（E+A），6 pmol；and pre-amplification primers（M+C），6 pmol. Also，the best selective amplification system （20.0 L） was 2.0 L，1/40 pre-amplification products；10 buffer，2.0 L； Mg2+，31.25 nmol；dNTP，4 pmol；Taq DNA polymerase，16.67 nkat；amplification primers（M+CNN），15 pmol；and amplification primers（E+ANN），12 pmol. Moreover，screening with the optimized AFLP reaction system resulted in 13 pairs of suitable amplification primers for AFLP analysis of Phoebe chekiangensis. ［Ch，5 fig. 3 tab. 24 ref.］ |
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