| 珍珠鸡MHC Ⅰ轻链基因的克隆、可溶性表达与纯化 |
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| 引用本文： | 李新生,闫若潜,方勤美,郝惠芳,崔沛,高风山,李云岗,徐守振,夏春.珍珠鸡MHC Ⅰ轻链基因的克隆、可溶性表达与纯化[J].中国畜牧兽医,2006,33(9):47-50. |
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| 作者姓名： | 李新生 闫若潜 方勤美 郝惠芳 崔沛 高风山 李云岗 徐守振 夏春 |
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| 作者单位： | 1. 中国农业大学动物医学院,农业部预防兽医学重点实验室,北京,100094;河南农业大学牧医工程学院,郑州,450002
2. 河南省兽医防治站,郑州,450002
3. 中国农业大学动物医学院,农业部预防兽医学重点实验室,北京,100094 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金项目(30371098) |
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| 摘 要： | 为了构建珍珠鸡MHCⅠ轻链β2m成熟肽基因的原核表达载体并在大肠杆菌中实现可溶性的表达,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法从鸡脾脏中提取总RNA,以总RNA为模板,5’-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)15-3’为反转录引物,采用T aK aR a AM V反转录酶合成F irst-strand cDNA(fcDNA)。根据G enB ank中登录的鸡的β2m基因序列,设计了分别含E coRⅠ和H indⅢ酶切位点的一对引物,分别扩增鸡β2m的成熟肽基因。PCR产物经纯化回收后,插入到含L acZ基因的原核克隆载体pGEM-T E asy中,转化至大肠杆菌JM 109感受态细胞,经E coRⅠ和H indⅢ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆。再把所克隆的片断亚克隆到表达载体pM AL-p2X,构建重组表达质粒p2Xβ-2m。将重组表达质粒转化入大肠杆菌E.coli TB 1感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明,本研究克隆了鸡β2m成熟肽基因序列,全长约297bp,编码约98个氨基酸,并可溶性表达了鸡β2m成熟肽蛋白质分子。采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化,并对纯化的表达产物进行了W estern b lot鉴定。本研究为进一步利用BF 2的胞外区在体外共同构建MHCⅠ类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础。
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| 关 键 词： | 珍珠鸡 轻链 RT-PCR 可溶性表达 纯化 |
| 文章编号： | 1671-7236(2006)09-0047-04 |
| 修稿时间： | 2005年12月1日 |
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