| 牛支原体重组蛋白P48原核表达、多克隆抗体制备及间接ELISA抗体检测方法的建立 |
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| 引用本文： | 张妍,战力源,姜福洁,马红霞,孔令聪.牛支原体重组蛋白P48原核表达、多克隆抗体制备及间接ELISA抗体检测方法的建立[J].中国畜牧兽医,2023(11):4621-4631. |
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| 作者姓名： | 张妍 战力源 姜福洁 马红霞 孔令聪 |
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| 作者单位： | 1. 吉林农业大学动物医学院;2. 吉林省新兽药研发与创制重点实验室;3. 生物反应器与药物开发教育部工程研究中心 |
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| 基金项目： | 吉林省科技发展计划项目(202537NY010575934)； |
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| 摘 要： | 【目的】建立牛支原体抗体间接ELISA检测方法，为牛支原体灭活疫苗的效力检测提供方法。【方法】构建pET-32a-P48原核表达质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)Plyss感受态细胞筛选阳性质粒并进行双酶切验证，用终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导重组蛋白表达，使用镍柱进行蛋白纯化，经SDS-PAGE验证蛋白纯度及分子质量大小，采用Western blotting检测重组P48蛋白特异性和反应原性；将重组P48蛋白免疫家兔制备多克隆抗体。建立牛支原体间接ELISA抗体检测方法并进行条件优化，确定阴阳性临界值。对建立的方法进行敏感性、稳定性、特异性及与平板凝集试验的符合率试验检测。【结果】经SDS-PAGE验证，P48蛋白分子质量大小为62.68 ku,纯度在90%以上；Western blotting检测结果显示，P48蛋白仅与相应抗体结合呈现单一条带，该蛋白特异性和反应原性良好；琼脂扩散方法测得阳性血清效价为1∶64。建立的间接ELISA检测方法条件优化结果为：抗原包被浓度为0.3μg/mL,1%BSA 37℃封闭120 min,待检血清按1∶1 280稀释，37℃孵育60 m...
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| 关 键 词： | 牛支原体 P48蛋白 间接ELISA |
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