| Cdc42蛋白在牛卵母细胞中的表达分布及对其成熟的影响 |
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| 引用本文： | 刘扬,银凤霞银凤霞,白春玲白春玲,魏著英魏著英,昝林森昝林森,李光鹏李光鹏.Cdc42蛋白在牛卵母细胞中的表达分布及对其成熟的影响[J].中国农业科学,2014,47(3):574-585. |
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| 作者姓名： | 刘扬 银凤霞银凤霞 白春玲白春玲 魏著英魏著英 昝林森昝林森 李光鹏李光鹏 |
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| 作者单位： | 1、西北农林科技大学动物科技学院/国家肉牛改良中心，陕西杨凌 712100；
2、内蒙古大学生命科学院/国家转基因动物研究中心，呼和浩特 010070 |
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| 基金项目： | 国家“十二五”转基因生物新品种培育重大专项（2011ZX08007-002）、国家科技支撑计划项目（2011BAD28B04-03）、国家“863”计划项目（2011AA100307—02和2013AA102505）、国家“973”计划项目（2012CB722306）、国家自然科学基金项目（31272411） |
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| 摘 要： | 【目的】探明Cdc42蛋白在牛卵母细胞成熟过程中的表达及分布规律，并且研究抑制Cdc42活性对于牛卵母细胞成熟的影响。【方法】首先通过收集体外成熟不同时间（0—24 h）的牛卵母细胞，用Western blotting的方法检测Cdc42蛋白在牛卵母细胞中的表达量变化情况，通过免疫细胞化学的方法检测Cdc42蛋白在牛卵母细胞中的分布及定位情况。根据GenBank公布的牛Cdc42基因（GenBank登录号：NM_001046332.1）的mRNA序列设计引物，并在正向和反向引物的末端分别加上KpnⅠ和EcoRⅠ酶切位点，用PCR的方法扩增牛Cdc42基因的CDS区，将PCR产物和pMD19T载体连接得到野生型的克隆载体pMD19T-Cdc42WT。用定点突变引物以pMD19T-Cdc42WT为模板进行PCR反应，得到Cdc42的显性负性突变体Cdc42T17N的克隆载体pMD19T-Cdc42T17N。将pMD19T-Cdc42WT和pMD19T-Cdc42T17N分别酶切后，将Cdc42WT（775 bp）和Cdc42T17N（775 bp）片段分别连接到pcDNA3.1（+）的多克隆位点区域，得到相应的原核表达载体pcDNA3.1（+）-Cdc42WT和pcDNA3.1（+）-Cdc42T17N。用体外转录的方法分别得到Cdc42WT和Cdc42T17N的cRNA，用显微注射的方法将相应的cRNA分别注入到牛GV期卵母细胞质内，检测其成熟率的变化。【结果】①Cdc42蛋白分别在牛卵母细胞中成熟培养0、4、8、12、16、20以及24 h时表达量没有明显差异，但是其分布规律随着减数分裂的进行发生着动态的变化：Cdc42蛋白在卵母细胞皮质区域集中分布的模式在生发泡（germinal vesicle，GV）期卵母细胞中很少出现，而在第一次减数分裂中期（metaphase Ⅰ，MⅠ）卵母细胞中出现得最多也最为明显；Cdc42蛋白在染色体附近的皮质富集的现象开始出现于前中期（pro-metaphase Ⅰ，pMⅠ），并且出现频率从pMⅠ期到第2次减数分裂中期（metaphase Ⅱ，MⅡ）逐渐增多；Cdc42蛋白和纺锤体重叠定位的现象在第1次减数分裂后期（anaphase Ⅰ，AⅠ）到末期（telophaseⅠ，TⅠ）的卵母细胞中占有有很高比例，而到MⅡ期时这种现象又很少出现。②从牛卵母细胞的总cDNA中扩增Cdc42基因得到785 bp的片段，构建的牛Cdc42的野生型及其显性负性突变体的克隆载体pMD19T-Cdc42WT和pMD19T-Cdc42T17N经酶切鉴定和以及测序比对后，符合预期结果，即成功克隆了牛野生型Cdc42基因并得到其显性负性突变体Cdc42T17N；③构建的相应的原核表达载体pcDNA3.1（+）-Cdc42WT和pcDNA3.1（+）-Cdc42T17N经酶切鉴定和测序比对，符合预期结果，经过体外转录均得到一个3079 bases和987 bases的RNA片段，符合预期结果，即成功构建了相应的原核表达载体并获得相应的cRNA；④与正常成熟培养组和注射Cdc42WTcRNA的牛卵母细胞相比，注射Cdc42T17NcRNA的成熟率显著降低（P<0.05）。【结论】卵母细胞在卵泡发育过程中就已经积累了足够的Cdc42蛋白，而在减数分裂过程中Cdc42可以在卵母细胞的皮质以及纺锤体的位置发挥作用，而且正常的Cdc42活性是牛卵母细胞完成成熟过程并排出第一极体所必需的。
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| 关 键 词： | Cdc42 免疫细胞化学 显性负性突变体 体外转录 显微注射 |
| 收稿时间： | 2013-05-17 |
Expression and Localization and Effect of Cdc42 Protein During the Maturation of Bovine Oocyte |
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| LIU Yang-,YIN Feng-Xia-Yin-Feng-Xia-,BAI Chun-Ling-Bai-Chun-Ling-,WEI Zhu-Ying-Wei-Zhu-Ying-,ZAN Lin-Sen-Zan-Lin-Sen-,LI Guang-Peng-Li-Guang-Peng-.Expression and Localization and Effect of Cdc42 Protein During the Maturation of Bovine Oocyte[J].Scientia Agricultura Sinica,2014,47(3):574-585. |
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| Authors: | LIU Yang- YIN Feng-Xia-Yin-Feng-Xia- BAI Chun-Ling-Bai-Chun-Ling- WEI Zhu-Ying-Wei-Zhu-Ying- ZAN Lin-Sen-Zan-Lin-Sen- LI Guang-Peng-Li-Guang-Peng- |
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| Institution: | 1、College of Animal Science and Technology/National Beef Cattle Improvement Center , Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi;
2、College of Life Science/National Research Center for Animal Transgenic Biotechnology, Inner Mongolia University, Hohhot 010070 |
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