| 摘 要： | 本研究旨在利用金标银染显色技术,构建同时检测禽白血病病毒(ALV)、鸡马立克病病毒(MDV)、传染性法氏囊病毒(IBDV)、新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)的可视化基因芯片。利用T-A法分别克隆得到ALV-env、MDV-meq、IBDV-vp_2基因,并利用本实验室已保存的AIV-np、NDV-f、ILTV-tk基因序列,设计寡核苷酸探针,制备ALV-MDV-IBDV-AIV-NDV-ILTV基因芯片阵列。引入生物素标记的引物进行PCR扩增,并与芯片进行杂交银染显色,肉眼观察检测结果,并对芯片的特异性、敏感性、稳定性进行评价,以及临床初步验证。成功克隆ALV-env、MDV-meq及IBDV-vp_2共3个靶基因,测序鉴定其正确性。发现寡核苷酸探针最优使用浓度为50μmol·L~(-1),40℃条件下杂交2 h,Nanogold-Streptavidin链霉亲和素溶液的质量浓度为4μg·mL~(-1),银染5 min,可见明显的检测信号。特异性试验显示,ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV、ILTV之间无交叉反应,且以鸡传染性支气管炎病毒为模板制备的PCR扩增标记不与ALV-MDV-IBDV-AIV-NDV-ILTV芯片杂交。芯片检测的灵敏度为1 pg·μL~(-1)。芯片在常温条件下保存60 d,在4℃条件下保存75 d仍可进行有效检测。临床病料检测结果与PCR检测结果一致。本研究成功构建同时检测ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV和ILTV的金标银染可视化基因芯片,并确定其最佳反应条件,为临床标准化应用奠定了基础。
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