| 菠菜乙醇酸氧化酶的酶学特性及同工酶电泳分析 |
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| 引用本文： | 罗莎,黄璐瑶,殷勤,张钰莹,赵燕,张智胜.菠菜乙醇酸氧化酶的酶学特性及同工酶电泳分析[J].华北农学报,2019,34(1). |
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| 作者姓名： | 罗莎 黄璐瑶 殷勤 张钰莹 赵燕 张智胜 |
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| 作者单位： | 湖南农业大学 生物科学技术学院,湖南 长沙,410128;湖南农业大学 南方粮油作物协同创新中心,湖南 长沙 410128;湖南农业大学 农学院,湖南 长沙 410128;湖南农业大学 生物科学技术学院,湖南 长沙 410128;湖南农业大学 南方粮油作物协同创新中心,湖南 长沙 410128 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金;湖南省自然科学基金;湖南省教育厅科学研究项目;湖南农业大学人才科学基金项目 |
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| 摘 要： | 为了解析菠菜乙醇酸氧化酶(Sp GLO)的酶学特性及同工酶谱。首先提取菠菜的RNA并反转录成c DNA,通过NCBI数据库中提供的菠菜GLO基因mRNA序列信息,设计特异性引物,扩增目标序列并连接到p MD19-T载体上进行测序鉴定;随后再次设计引物并在上游引物加入His标签,克隆Sp GLO基因构建到p YES2载体上,将该载体转入酿酒酵母中进行表达并通过His-tag亲和柱纯化,然后在不同诱导时间点取样测定Sp GLO酶活。结果显示,转化后的酿酒酵母菌株在诱导发酵20 h后能得到最高的GLO活性。以乙醇酸为底物测定Sp GLO在不同p H、不同温度条件下的催化活性,其最适p H值为8. 0,最适温度为39℃。然后分别以乙醇酸、乙醛酸、甘油酸为反应底物,系统分析了Sp GLO的酶学特性,数据显示,Sp GLO对乙醇酸的亲和力最高,其Km为0. 41 mmol/L,Vm为45. 92μmol/(min·mg)。以乙醇酸、乙醛酸为底物,使用草酸抑制其催化活性,其Ki分别为4. 61,2. 09 mmol/L,表明以乙醛酸为底物时Sp GLO的催化活性更易被草酸抑制。同时将纯化后的Sp GLO通过Caps-氨水电泳体系进行同工酶电泳,经过染色后出现2条同工酶带,表明菠菜叶片中可能存在2种GLO同工酶。为将来深入研究植物GLO同工酶之间的生化特性差异并分析其不同生理功能奠定良好的基础。
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| 关 键 词： | 乙醇酸氧化酶 酶学特性 同工酶电泳 菠菜 |
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