| 胞外区基因的克隆、可溶性表达和纯化 |
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| 引用本文： | 李新生,,杜向党,陈红英,高风山,李云岗,夏春.胞外区基因的克隆、可溶性表达和纯化[J].中国畜牧兽医,2007,34(9):53-57 . |
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| 作者姓名： | 李新生 杜向党 陈红英 高风山 李云岗 夏春 |
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| 作者单位： | 1.河南农业大学牧医工程学院,郑州 450002； 2.中国农业大学动物医学院,农业部预防兽医学重点实验室,北京 100094 ; |
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| 摘 要： | 从鸡脾脏中提取总 RNA,以总RNA为模板,5’-ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-(T)15-3’为反转录引物,采用TaKaRa AMV反转录酶合成First-strand cDNA (fcDNA)。根据GenBank中登录的鸡的BF2基因胞外区序列,设计了含EcoRⅠ和 HindⅢ 酶切位点的2对引物,分别扩增鸡BF2的胞外区基因。PCR产物经纯化回收后,插入到含LacZ基因的原核克隆载体pGEM-T Easy中,转化至大肠杆菌JM109感受态细胞,经EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切及PCR鉴定,筛选出阳性克隆。再把所克隆的片段亚克隆到表达载体pMAL-p2X vector,构建重组质粒p2X/BF2（1-5）。将重组表达质粒转化入大肠杆菌TB1感受态细胞,筛选阳性克隆,经IPTG诱导表达后,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。结果表明,本研究克隆了5类鸡BF2的胞外区基因序列,试验结果证明本研究已成功克隆并可溶性表达了5类BF2胞外区蛋白质分子,全长约807~819 bp,编码约269~273个氨基酸。采用淀粉树脂柱亲和层析和DEAE凝胶过滤方法对表达产物进行了纯化,并对纯化的表达产物进行了western blot鉴定。本研究为进一步利用BF2的胞外区在体外构建MHC Ⅰ类分子结合筛选抗原表位肽平台奠定了基础。
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| 关 键 词： | 鸡BF2基因 胞外区 pMAL/p2X系统 可溶性表达 纯化 切割 |
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