| 猪病毒性腹泻病金标银染可视化芯片技术实验条件优化研究及应用 |
| |
| 引用本文： | 马锐,黄小波,杨国淋,滑翔,赵玉佳,文心田,曹三杰,文翼平,伍锐.猪病毒性腹泻病金标银染可视化芯片技术实验条件优化研究及应用[J].农业生物技术学报,2016(8):1233-1242. |
| |
| 作者姓名： | 马锐 黄小波 杨国淋 滑翔 赵玉佳 文心田 曹三杰 文翼平 伍锐 |
| |
| 作者单位： | 四川农业大学动物医学院/猪病研究中心与基因芯片实验室,成都,611130 |
| |
| 基金项目： | 公益性行业(农业)科研专项项目(No.201203056) |
| |
| 摘 要： | 基因芯片标准化是其特异灵敏检测病原的基本保障,本研究针对金标银染可视化基因芯片制备中点样缓冲液的使用、点样次数、杂交温度、杂交时间、胶体金浓度以及银染时间分别进行优化实验,分析其对金标银染可视化共检基因芯片杂交信号的影响.分别选取猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)的S和M基因,猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis of swine virus,TGEV)的N和S基因,A型猪轮状病毒(Group A porcine rotavirus,GAR)的VP7和NSP4基因设计引物.根据目的基因片段设计5’端修饰有15个T碱基的60-mer寡核苷酸探针,分别以1∶1混合点样缓冲液和直接进行喷样两种方式,利用芯片点样仪喷样分别喷样1次、2次、3次于醛基玻片上制成基因芯片.应用不对称PCR对实验室构建保存的三种腹泻病毒的阳性质粒进行生物素掺入标记,分别在40、45、50和55℃与基因芯片杂交30、60、90和120 min.利用生物素-链霉亲和素的特异性链接,分别将稀释10、20、30、40、50及60倍的链霉亲和素修饰的纳米金颗粒引入反应体系,通过不同银离子染色时间后后,直接眼观实验结果.应用优化后的标准化可视化芯片和RT-PCR同时对173份临床送检病料进行检测,以评价芯片临床应用.结果表明,应用探针和点样缓冲液1∶1混合的方法进行1次喷样制作的基因芯片,在50℃环境中杂交90 min后,与4μg/mL链霉亲和素修饰的纳米金颗粒结合,再进行12～14 min银染,经过10次重复性实验,可确定为金标银染可视化基因芯片的最佳优化条件.临床病料可视化芯片检测结果与RT-PCR检测结果一致.本研究确定了病毒性腹泻可视化共检芯片的最佳反应条件,为该技术的临床应用标准化研究奠定了基础.
|
| 关 键 词： | 猪腹泻病毒 基因芯片 金标银染 条件优化 |
The Optimization and Application of Swine Diarrhea Virus Visual Microarray Based on Gold Labeled Silver Staining |
| |
| Abstract: | |
| |
| Keywords: | Porcine epidemic diarrhea virus Microarray Gold label silver stain Optimal conditions |
| 本文献已被 万方数据 等数据库收录！ |
|
