| 家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP141的表达特征及对饥饿的响应 |
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| 引用本文： | 刘华伟,李游山,唐新,张晓璐,赵萍.家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP141的表达特征及对饥饿的响应[J].中国农业科学,2016,49(6):1207-1218. |
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| 作者姓名： | 刘华伟 李游山 唐新 张晓璐 赵萍 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金（31472154）、西南大学博士基金（swu115024） |
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| 摘 要： | 【目的】分析家蚕(Bombyx mori)丝氨酸蛋白酶基因BmSP141序列信息,明确其时空表达模式,结合饥饿与重新喂食处理对其表达的影响,探究该基因在家蚕中的功能。【方法】对家蚕丝氨酸蛋白酶基因BmSP141进行T-A克隆,得到其编码区核苷酸序列;应用生物信息学在线网站对该基因编码区推导的氨基酸序列、分子量、结构域等信息进行分析;利用Clustal X1.8和MEGA5.02软件对BmSP141与其他物种的丝氨酸蛋白酶进行多序列比对和系统发生树分析;构建原核表达载体p28-BmSP141,并转化到Rosetta(DE3)菌株中诱导表达,利用镍柱亲和层析纯化重组蛋白。利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR方法对其组织和时期表达特征进行分析;采用蛋白质免疫印迹(Western blot)技术,分别分析BmSP141蛋白在家蚕5龄第3天各组织的表达情况和5龄幼虫中肠的表达变化;通过免疫荧光定位分析BmSP141蛋白在4龄幼虫中肠的分布情况;利用实时荧光定量PCR和Western blot方法对饥饿处理和再喂食后BmSP141的表达情况进行分析。【结果】BmSP141编码含有292个氨基酸的蛋白,其中第1—17位氨基酸为信号肽,其成熟体蛋白预测分子量为25.9 k D,等电点为7.8。同源序列比对表明,BmSP141与烟芽夜蛾丝氨酸蛋白酶和蓓带夜蛾丝氨酸蛋白酶序列同源性较高,分别达到62%和63%。这些同源序列具有保守的催化三联体,与活性相关的基序也很保守,但与胰凝乳蛋白酶保守的底物特异性位点相比,BmSP141的底物特异性位点发生改变。在16和37℃条件下诱导后,重组蛋白均以包涵体形式表达,经镍柱亲和层析纯化后得到了较纯的重组蛋白,并用该蛋白制备了效价较高的多克隆抗体。组织和时期表达特征分析表明,该基因主要在家蚕幼虫的中肠组织特异性表达,且在幼虫起蚕到食桑期表达逐渐增加,但眠期表达下降,蛹期和成虫期表达水平较低。Western blot分析也表明,BmSP141蛋白仅在家蚕中肠组织表达,且从5龄起蚕到上蔟表达量先增加后降低。免疫荧光定位结果表明,BmSP141定位于中肠上皮细胞的细胞质中,进一步证实BmSP141在中肠特异表达。在转录和翻译水平,BmSP141饥饿处理后表达量显著下调,而重新喂食后其表达量上调,表明BmSP141的表达受到消化道食物的诱导。【结论】家蚕丝氨酸蛋白酶BmSP141在中肠组织表达,在幼虫期食桑期高表达,蛹期和成虫期表达水平较低,受消化道食物的诱导而上调表达,推测该基因可能参与家蚕中肠的消化过程。
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| 关 键 词： | 家蚕 丝氨酸蛋白酶 中肠 饥饿 表达分析 |
| 收稿时间： | 2015-10-30 |
Characterization and Expression Analysis of Serine Protease BmSP141 from the Silkworm (Bombyx mori ) in Response to Starvation |
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| LIU Hua-wei,LI You-shan,TANG Xin,ZHANG Xiao-lu,ZHAO Ping.Characterization and Expression Analysis of Serine Protease BmSP141 from the Silkworm (Bombyx mori ) in Response to Starvation[J].Scientia Agricultura Sinica,2016,49(6):1207-1218. |
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| Authors: | LIU Hua-wei LI You-shan TANG Xin ZHANG Xiao-lu ZHAO Ping |
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| Institution: | 1.State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Southwest University, Chongqing 400716;2.Vitamin D Research Institute, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723001, Shaanxi |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | Bombyx mori serine protease midgut starvation expression analysis |
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