| 进境大豆种子上菜豆荚斑驳病毒和大豆花叶病毒的多重RT-PCR检测 |
| |
| 引用本文： | 沈建国,高芳銮,蔡伟,金晶,廖富荣,吴祖建.进境大豆种子上菜豆荚斑驳病毒和大豆花叶病毒的多重RT-PCR检测[J].中国农业科学,2016,49(4):667-676. |
| |
| 作者姓名： | 沈建国 高芳銮 蔡伟 金晶 廖富荣 吴祖建 |
| |
| 作者单位： | 1福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心/福建省检验检疫技术研究重点实验室，福州 350001
2福建农林大学植物病毒研究所，福州 350002
3厦门出入境检验检疫局检验检疫技术中心，福建厦门 361012 |
| |
| 基金项目： | 国家质检公益性行业科研专项（201410076）、福建省杰出青年科学基金（2014J06008）、福州市科技计划（2013-N-54） |
| |
| 摘 要： | 【目的】针对进境大豆种子上症状相似的菜豆荚斑驳病毒（Bean pod mottle virus，BPMV）和大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus，SMV），建立同时快速检测2种病毒的多重RT-PCR技术。【方法】根据GenBank公布的BPMV、SMV外壳蛋白基因序列，设计2对特异性引物，以复合感染BPMV、SMV的大豆种子为材料，提取dsRNA作为模板进行多重RT-PCR的引物浓度、退火温度和循环数的优化。利用优化建立的多重RT-PCR方法分别对健康大豆种子、BPMV、SMV及2种病毒复合感染的大豆种子进行检测，测定该方法的特异性。利用健康大豆种子提取的dsRNA，将从复合侵染BPMV、SMV大豆种子中提取的dsRNA按10倍梯度稀释，依次稀释为原液的10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6倍作为模板，分别进行多重RT-PCR和单一RT-PCR扩增，测定灵敏度。多重RT-PCR扩增产物回收纯化后，连接于pMD18-T载体，进行克隆测序和序列比对，进一步验证该方法的可靠性。应用建立的多重RT-PCR方法对来自于美国、阿根廷、中国和巴西的疑似带病大豆种子进行检测，同时以单一RT-PCR检测进行验证。以BPMV、SMV抗体等体积混合液包被PCR管后再加入样品提取液或直接以样品提取液包被PCR管，将免疫捕获、试管捕捉和多重RT-PCR相结合，建立同时检测BPMV、SMV的多重一步IC-RT-PCR、多重一步TC-RT-PCR方法。【结果】多重RT-PCR的优化结果显示，最佳引物浓度为BPMV 0.4μmol·L-1、SMV 0.4 μmol·L-1，最佳退火温度为52℃，最佳循环数为35。特异性测定结果表明，多重RT-PCR能够从复合感染BPMV、SMV的大豆种子上同时扩增到大小约542、221 bp特异性目的条带，从单一感染BPMV的大豆种子上扩增到大小约542 bp特异性目的条带，从单一感染SMV的大豆种子上扩增到大小约221 bp特异性目的条带，而从健康大豆种子材料上未扩增出任何特异性条带。灵敏度测定结果表明，当dsRNA原液稀释至10-3倍时，无论是多重RT-PCR，还是单一RT-PCR均未扩增出特异性目的条带，多重RT-PCR与单一RT-PCR的灵敏度相当，为10-2倍dsRNA原液。多重RT-PCR扩增产物克隆测序和序列比对结果显示，BPMV、SMV所测的序列全长分别为542和221 bp，与预期大小完全相符，且与已报道的各病毒基因序列高度同源，证实了多重RT-PCR结果的可靠性。应用建立的多重RT-PCR方法分别对来自于4个国家的大豆种子样品进行检测，结果从3份美国大豆种子样品检出BPMV，1份美国大豆种子检出SMV，1份阿根廷大豆种子检出SMV，2份中国大豆种子检出SMV，该结果与单一RT-PCR验证结果一致，阳性符合率达100% 。建立的多重一步IC-RT-PCR、多重一步TC-RT-PCR方法能够从复合感染BPMV、SMV的大豆种子中成功扩增出2条特异性目的条带，而从健康大豆种子中未扩增出特异性目的条带。【结论】建立的多重RT-PCR检测方法为进境大豆种子上BPMV、SMV的快速检测提供了参考。
|
| 关 键 词： | 菜豆荚斑驳病毒 大豆花叶病毒 多重RT-PCR 双链RNA |
| 收稿时间： | 2015-09-16 |
Multiplex RT-PCR for Simultaneous Detection of Bean pod mottle virus and Soybean mosaic virus in Imported Soybean Seeds |
| |
| SHEN Jian-guo,GAO Fang-luan,CAI Wei,JIN Jing,LIAO Fu-rong,WU Zu-jian.Multiplex RT-PCR for Simultaneous Detection of Bean pod mottle virus and Soybean mosaic virus in Imported Soybean Seeds[J].Scientia Agricultura Sinica,2016,49(4):667-676. |
| |
| Authors: | SHEN Jian-guo GAO Fang-luan CAI Wei JIN Jing LIAO Fu-rong WU Zu-jian |
| |
| Institution: | 1Inspection & Quarantine Technology Center, Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau/Fujian Key Laboratory for Technology Research of Inspection and Quarantine, Fuzhou 350001
2Institute of Plant Virology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002
3Inspection & Quarantine Technology Center, Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Xiamen 361012, Fujian |
| |
| Abstract: | |
| |
| Keywords: | Bean pod mottle virus (BPMV) Soybean mosaic virus (SMV) multiplex RT-PCR dsRNA |
| 本文献已被 CNKI 等数据库收录！ |
| 点击此处可从《中国农业科学》浏览原始摘要信息 |
| 点击此处可从《中国农业科学》下载免费的PDF全文 |
