| 鳜AKT2在传染性脾肾坏死病毒增殖中的作用 |
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| 引用本文： | 明 月,牛银杰,付小哲,等.鳜AKT2在传染性脾肾坏死病毒增殖中的作用[J].西北农林科技大学学报(社会科学版),2021,49(2):14-22. |
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| 作者姓名： | 明 月 牛银杰 付小哲 等 |
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| 作者单位： | 中国水产科学研究院 珠江水产研究所,上海海洋大学 水产与生命学院 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金项目（31872589）；国家重点研发计划项目（2018YFD0900501，2019YDF0900105）；广东省促进经济发展专项（海洋经济发展用途）(GDME-20181007)；广东省农业产业技术体系创新团队项目（2019KJ141） |
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| 摘 要： | 【目的】研究鳜AKT2 (ScAKT2)在传染性脾肾坏死病毒（infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV）增殖中的作用,为鳜ISKNV防控提供参考。【方法】克隆ScAKT2基因开放阅读框，构建原核表达载体,进行原核表达及蛋白纯化。用纯化后的ScAKT2重组蛋白免疫日本大耳兔后制备多克隆抗体，用间接ELISA法检测抗体的效价，用间接免疫荧光和Western blot法测定抗体的特异性。克隆鳜AKT2基因，构建过表达载体pCMV-EGFP-ScAKT2，将其转染至CPB细胞系中构建ScAKT2过表达细胞系，用荧光显微镜检测转染效率，用qRT-PCR法及Western blot法分别测定ScAKT2 mRNA水平和蛋白水平的表达，以鉴定ScAKT2过表达细胞系是否构建成功。将ISKNV接种至ScAKT2过表达细胞系中，用qPCR法及Western blot法分别测定ISKNV病毒拷贝数及ISKNV-MCP蛋白的表达，用qRT-PCR法测定ScIRF3、ScIRF7、ScMx、ScIL8、ScTRAF2和ScTRAF3等先天免疫因子mRNA水平的表达情况。【结果】PCR扩增获得1 400 bp的AKT2 ORF片段，成功构建了原核表达质粒，诱导表达出72 ku的重组蛋白。成功制备了ScAKT2多克隆抗体，抗体效价达1∶256 000，纯化后质量浓度约为10 mg/mL。成功构建了pCMV-EGFP-ScAKT2过表达载体和过表达ScAKT2的CPB细胞系，过表达ScAKT2 CPB细胞可极显著抑制ISKNV的增殖，能明显上调ScIRF3、ScIRF7、ScMx、ScIL8、ScTRAF2和ScTRAF3等先天免疫因子mRNA的表达水平。【结论】ScAKT2通过上调先天免疫因子的表达抑制ISKNV的增殖，为鳜ISKNV防控提供了新的潜在靶点。
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| 关 键 词： | 鳜 AKT2 传染性脾肾坏死病毒 病毒增殖 |
| 收稿时间： | 2019/12/31 0:00:00 |
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