| 禽致病性大肠杆菌HPI毒力岛irp2蛋白表达、纯化及其间接ELISA方法建立 |
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| 引用本文： | 王艳萍,郭时金,徐倩倩,苗立中,刘吉山,沈志强,莫玲,董林,李风叶.禽致病性大肠杆菌HPI毒力岛irp2蛋白表达、纯化及其间接ELISA方法建立[J].中国兽医学报,2018(2). |
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| 作者姓名： | 王艳萍 郭时金 徐倩倩 苗立中 刘吉山 沈志强 莫玲 董林 李风叶 |
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| 作者单位： | 山东省滨州畜牧兽医研究院;山东省滨州畜禽蜂胶疫苗研究开发推广中心;山东绿都安特动物药业有限公司;山东省滨州市畜牧兽医局; |
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| 摘 要： | PCR扩增irp2主要抗原表位区,构建pET-32α-irp2表达载体,转化BL21(DM3)细胞诱导表达。以纯化irp2蛋白为抗原建立ELISA检测方法,确定抗原包被浓度、血清稀释度、封闭液与封闭条件和临界值等参数,进行ELISA性能检测及应用。结果显示,PCR扩增出约519bp特异性irp2主要抗原表位基因,经菌液PCR、双酶切及DNA测序显示成功构建pET-32α-irp2表达载体。irp2目的蛋白获得有效表达,相对分子质量大小约34 500,亲和纯化后纯度达90%以上。Western blot显示目的蛋白irp2与抗血清在约34 500出现特异性显示条带。确定ELISA抗原包被质量浓度3.25mg/L、血清稀释度1∶80,封闭液为5%脱脂奶粉,封闭条件37℃1h+4℃10h,临界值为0.320。性能检测显示,其敏感性可达1∶5 120;与鸡白痢沙门菌、鸡传染性鼻炎、鸡霉形体、鸡巴氏杆菌、HPI-大肠杆菌等血清无交叉反应特异性,批内、批间变异系数分别为3.40%~6.71%和5.20%~8.44%;与PCR方法对124份血清平行试验其符合率93.8%;对1 425份临床血清样品irp2抗体阳性检出率37.4%。结果表明,建立了可检测血清中irp2蛋白抗体的间接ELISA方法,适用于临床血清样品进行快速抗体检测,为HPI大肠杆菌的流行病学调查和致病性大肠杆菌免疫机制研究奠定基础。
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| 关 键 词： | 大肠杆菌 毒力岛 irp2 ELISA |
Establishment of indirect ELISA method and avian pathogenic E.coli HPI irp2 protein expression and purification |
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