绵羊肺炎支原体p74基因重组单核细胞增生李斯特菌的构建及其免疫原性分析 |
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引用本文: | 卢海亭,乔 军,孟庆玲,等.绵羊肺炎支原体p74基因重组单核细胞增生李斯特菌的构建及其免疫原性分析[J].西北农林科技大学学报(社会科学版),2017,45(8):7-14. |
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作者姓名: | 卢海亭 乔 军 孟庆玲 等 |
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作者单位: | 石河子大学 动物科技学院,石河子大学 动物科技学院,石河子大学 动物科技学院 |
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基金项目: | 国家自然科学基金项目(31360596);国家国际科技合作专项(2014DFR31310) |
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摘 要: | 【目的】构建绵羊肺炎支原体(MO)p74基因重组单核细胞增生李斯特菌(LM)并分析其免疫原性,为研发MO重组活疫苗奠定基础。【方法】采用PCR方法从LM-SB5株基因组中扩增出rli60基因的上、下游同源片段a和b,从质粒pET-32a(+)-p74中扩增出MOp74目的基因片段,利用重叠延伸PCR方法(SOE-PCR)将扩增的3个片段融合成ap74b基因片段,克隆入pMD19-T载体中进行测序鉴定。将ap74b片段从pMD19-T载体上切下亚克隆入pKSV7穿梭载体,构建pKSV7-ap74b重组穿梭质粒,电转化至LM-SB5株感受态细胞,用氯霉素和高温双重压力筛选得到重组菌LM-Δrli60-ap74b。并通过SDS-PAGE及Western blot分析重组菌P74蛋白的表达情况,通过小鼠免疫试验检测其免疫原性。【结果】成功扩增出了rli60基因的上下游同源片段a、b及p74目的片段,采用SOEPCR方法获得融合片段ap74b,并成功亚克隆于穿梭质粒pKSV7中。对重组菌PCR鉴定结果表明,外源基因MO p74定点整合于LM基因组中。体外稳定性检验表明,p74基因能在LM基因组中稳定存在。SDS-PAGE结果表明,重组菌LM-Δrli60-ap74b可表达蛋白分子质量约为17ku重组蛋白;Western blot分析表明,表达的重组蛋白能与MO阳性血清发生特异性免疫反应。小鼠免疫试验表明,重组菌LM-Δrli60-ap74b菌液可诱导机体产生抗MO特异性抗体,证实该重组菌具有一定的免疫原性,重组菌能诱导机体产生1∶8~1∶16的抗体效价。【结论】获得了具有免疫原性的绵羊肺炎支原体p74基因重组单核细胞增生李斯特菌。
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关 键 词: | 绵羊肺炎支原体 单核细胞增生李斯特菌 p74基因 同源重组 |
收稿时间: | 2016/5/25 0:00:00 |
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