| 伪狂犬病病毒在NF-κB家族p65基因敲除细胞系的复制规律研究 |
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| 引用本文： | 常雯茹,段利芳,杨乐,马英先,王棋,翟云云,周鲁豫,张爽,明胜利,杨国宇,王江,褚贝贝.伪狂犬病病毒在NF-κB家族p65基因敲除细胞系的复制规律研究[J].中国畜牧兽医,2021(1). |
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| 作者姓名： | 常雯茹 段利芳 杨乐 马英先 王棋 翟云云 周鲁豫 张爽 明胜利 杨国宇 王江 褚贝贝 |
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| 作者单位： | 河南农业大学;河南农业大学 |
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| 基金项目： | 优势特色学科建设经费(203/18xk0102);万人计划青年拔尖人才(W03070106);河南省高校青年骨干教师(2016GGJS-033);河南省自然科学基金面上项目(83);河南省重点研发与推广专项(202102110100)。 |
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| 摘 要： | 试验旨在研究伪狂犬病病毒(PRV)在NF-κB家族p65基因敲除细胞系中的复制规律。利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因定点修饰技术构建猪肺泡巨噬细胞(3D4/21)p65基因稳定敲除细胞系。通过构建p65-sgRNA重组质粒,转染至HEK293T/17细胞,收取慢病毒,感染3D4/21细胞后利用嘌呤霉素筛选获得多克隆细胞系,T7核酸酶检测敲除效率,再通过有限稀释法获得3D4/21-p65^-/-的稳定细胞系。CCK-8试剂盒检测3D4/21细胞中敲除p65基因后对细胞增殖的影响;流式细胞术检测PRV-GFP感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后病毒增殖的差异;实时定量PCR检测PRV感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、TK基因mRNA表达水平及PRV感染细胞诱导的IL-1β和IL-6基因mRNA水平表达的变化;Western blotting检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定检测PRV-QXX感染3D4/21及3D4/21-p65^-/-细胞后子代病毒滴度。结果表明,sgRNA2和sgRNA3的基因编辑效率较高,对其进行克隆化培养进而获得敲除p65基因的稳定表达细胞系;CCK-8试剂盒检测细胞活力表明,p65基因敲除对细胞活力无影响;流式细胞仪检测表明,同一时间点PRV-GFP在3D4/21-p65^-/-中的增殖显著高于对照细胞;实时荧光定量PCR表明在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、TK基因的mRNA表达水平,而抑制了IL-1β、IL-6基因的mRNA表达;Western blotting结果表明,在3D4/21细胞中敲除p65基因促进了PRV gB、gE蛋白的表达;滴度测定结果表明,同一时间点PRV-QXX在3D4/21-p65^-/-细胞中子代病毒的复制显著高于对照细胞。以上结果均表明,p65基因敲除可促进PRV在3D4/21细胞中复制。
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| 关 键 词： | CRISPR/Cas9 NF-ΚB 猪 伪狂犬病病毒(PRV) |
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