| CRISPR/Cas13d介导猪胎儿成纤维细胞SUV39H1/SUV39H2基因敲降 |
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| 引用本文： | 毕登峰,王煜,姚婧,赵建国.CRISPR/Cas13d介导猪胎儿成纤维细胞SUV39H1/SUV39H2基因敲降[J].中国畜牧兽医,2021,48(6):1957-1966. |
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| 作者姓名： | 毕登峰 王煜 姚婧 赵建国 |
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| 作者单位： | 1. 中国科学技术大学, 合肥 230026;2. 中国科学院动物研究所, 北京 100101 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金（81671274、31601008） |
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| 摘 要： | 研究旨在利用CRISPR/Cas13d系统对猪胎儿成纤维细胞（PEF）中的胚胎发育相关基因SUV39H1/SUV39H2进行RNA水平的敲降，从而在猪上建立CRISPR/Cas13d介导的基因敲降系统。根据SUV39H1、SUV39H2基因的编码序列各设计3个靶向编码链的sgRNAs，并以单链寡核苷酸的形式合成，退火后与BspQⅠ线性化的sgRNA表达载体进行连接，构建SUV39H1-sgRNA和SUV39H2-sgRNA表达载体，用Sanger软件进行测序；将Cas13d表达载体和靶向SUV39H1/SUV39H2基因的sgRNA载体按照1∶1、1∶2、1∶4、2∶1和4∶1比例转染猪胎儿成纤维细胞，48 h后收集细胞，用流式细胞术分选检测细胞转染效率，用半定量PCR和实时荧光定量PCR检测敲降效率；用半定量PCR和免疫荧光检测敲降SUV39H1/SUV39H2基因后，靶基因转录水平及组蛋白H3K9me3水平的变化。测序结果表明，针对2个基因设计的各3条sgRNAs均成功连入载体中；流式细胞术分选结果显示，转染效率约70%；半定量PCR结果表明，与对照组相比，3个sgRNAs均极显著降低了SUV39H1和SUV39H2基因的表达（P<0.01），其中SUV39H1-sgRNA-2和SUV39H2-sgRNA-1均可使SUV39H1和SUV39H2的表达降低50%；Cas13d∶sgRNA为1∶1、1∶2和1∶4组细胞的存活率高于2∶1和4∶1组；实时荧光定量PCR结果表明，Cas13d∶sgRNA为1∶2、1∶4、2∶1和4∶1组敲降效率均显著高于1∶1组（P<0.05），且Cas13d∶sgRNA为1∶2组敲降效率最高（70%）。半定量PCR结果显示，转染SUV39H1-sgRNA-2和SUV39H2-sgRNA-1极显著降低SUV39H1和SUV39H2的表达，表达量为对照组的25%~30%（P<0.01）。免疫荧光检测结果表明，敲降SUV39H1和SUV39H2基因后，组蛋白H3K9me3水平显著降低（P<0.05）。因此，本研究利用CRISPR/Cas13d系统在猪胎儿成纤维细胞中成功敲降SUV39H1和SUV39H2，并下调其催化的H3K9me3水平。
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| 关 键 词： | CRISPR/Cas13d SUV39H1/SUV39H2基因 敲降 猪胎儿成纤维细胞 |
| 收稿时间： | 2020-09-14 |
CRISPR/Cas13d-mediated SUV39H1/SUV39H2 Gene Knockdown in Porcine Embryonic Fibroblasts |
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| BI Dengfeng,WANG Yu,YAO Jing,ZHAO Jianguo.CRISPR/Cas13d-mediated SUV39H1/SUV39H2 Gene Knockdown in Porcine Embryonic Fibroblasts[J].China Animal Husbandry & Veterinary Medicine,2021,48(6):1957-1966. |
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| Authors: | BI Dengfeng WANG Yu YAO Jing ZHAO Jianguo |
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| Institution: | 1. University of Science and Technology of China, Hefei 230026, China;2. Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China |
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| Abstract: | |
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| Keywords: | CRISPR/Cas13d SUV39H1/SUV39H2 genes knockdown porcine embryonic fibroblasts |
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