| 慢病毒介导稳定表达 Cas9 蛋白的鸡成纤维细胞系构建及其活性验证 |
| |
| 引用本文： | 李晓娇,朱新宇,邹 娴,严 霞,何燕华,罗成龙.慢病毒介导稳定表达 Cas9 蛋白的鸡成纤维细胞系构建及其活性验证[J].广东农业科学,2023,50(2):125-135. |
| |
| 作者姓名： | 李晓娇 朱新宇 邹 娴 严 霞 何燕华 罗成龙 |
| |
| 作者单位： | 1. 仲恺农业工程学院动物科技学院，广东 广州 510225；2. 广东省农业科学院动物科学研究所 /畜禽育种国家重点实验室 / 广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广东 广州 510640 |
| |
| 基金项目： | 云浮市 2021 年省乡村振兴战略专项（2021020608）；广东省重点领域研发计划项目（2022B0202110002）；国家自然科学基金青年科学基金（32102539）；广东省农业科学院协同创新中心项目（XT202217）；国家肉鸡产业技术体系岗位科学家项目（CARS-41） |
| |
| 摘 要： | 【目的】筛选稳定表达 Cas9 蛋白的鸡成纤维细胞系（DF-1），并基于单链退火修复机制（Single Strand Annealing, SSA）的报告载体系统，检测 DF-1 细胞系中的 Cas9 核酸酶活性。【方法】将携带 Cas9 蛋白的慢病毒载体质粒与辅助质粒一起转染 293T 细胞包装慢病毒，收集慢病毒 Cas9 上清液感染 DF-1 细胞，经抗生素筛选得到稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞，分别用 PCR 和 Western blot 验证阳性 DF-1 细胞表达 Cas9 蛋白的情况；选择鸡卵清白蛋白（OVA）基因的 sgRNA 序列，将 sgRNA 退火产物克隆至 pYP152 构建 sgRNA 表达载体，并在 sgRNA 靶位点两端设计引物扩增 OVA 基因靶片段，将靶片段克隆至报告载体 pCMV-SSA-mCherry-Hind Ⅲ，以破坏 mCherry 蛋白的表达，之后再将 sgRNA 表达载体与 SSA 报告载体共同转染稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞，最后在荧光显微镜下分析不同稳转株对 mCherry 蛋白表达的修复情况。【结果】经抗生素筛选得到 27 株稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞系，采用 PCR 扩增稳转细胞基因组，结果显示这些细胞具有 Cas9 蛋白基因序列，Western blots 试验结果显示上述稳转细胞株均表达 Cas9 蛋白；sgRNA 表达载体与 mCherry-SSA 报告载体共转后，通过荧光显微镜观察发现筛选到的稳转细胞株均可恢复报告载体中 mCherry 蛋白的表达。【结论】成功构建了具有切割活性的稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞系，可为后续在稳定表达 Cas9 蛋白的 DF-1 细胞系上开展鸡相关功能基因研究提供基础材料。
|
| 关 键 词： | 稳定表达 慢病毒 CRISPR/Cas9 SSA 修复 载体构建 DF-1 |
Construction of DF-1 Cell Line of Stably Expressing Cas9 Protein Mediated by Lentivirus and Verification of Its Activity |
| |
| LI Xiaojiao,ZHU Xinyu,ZOU Xian,YAN Xi,HE Yanhu,LUO Chenglong.Construction of DF-1 Cell Line of Stably Expressing Cas9 Protein Mediated by Lentivirus and Verification of Its Activity[J].Guangdong Agricultural Sciences,2023,50(2):125-135. |
| |
| Authors: | LI Xiaojiao ZHU Xinyu ZOU Xian YAN Xi HE Yanhu LUO Chenglong |
| |
| Abstract: | |
| |
| Keywords: | stable expression lentivirus CRISPR/Cas9 SSA repair vector construction DF-1 |
|
| 点击此处可从《广东农业科学》浏览原始摘要信息 |
| 点击此处可从《广东农业科学》下载免费的PDF全文 |
