| 香鱼Wap65-2在昆虫杆状病毒系统中的表达及其与补体C3的相互作用验证 |
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| 引用本文： | 马文静,陈凯,史雨红,陈炯.香鱼Wap65-2在昆虫杆状病毒系统中的表达及其与补体C3的相互作用验证[J].农业生物技术学报,2018(10). |
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| 作者姓名： | 马文静 陈凯 史雨红 陈炯 |
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| 作者单位： | 宁波大学海洋学院生物化学与分子生物学实验室 |
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| 摘 要： | Wap65-2 (Warm temperature acclimation related 65 kD protein-2)是至今仅在鱼类中发现的糖蛋白,与鱼类温度、细菌感染、重金属等胁迫等紧密相关。近年来其在鱼类抗细菌免疫反应中的作用引起广泛关注。本研究主要利用昆虫细胞杆状病毒载体系统(baculovirus expression vector system, BEVS)表达重组香鱼(Plecoglossus altivelis) Wap65-2成熟肽(recombinant ayu mature Wap65-2, rPaWap65-2m),建立真核生物表达具有生物活性rPaWap65-2m的制备方法。首先克隆获得香鱼Wap65-2基因的重组杆粒,将重组杆粒转染草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢细胞(Sf9)获得病毒储液,用高滴度P3代病毒储液继续感染Sf9细胞,Western blot技术检测培养基中的重组蛋白。在最佳条件下无血清悬浮扩大培养,收集培养基上清,再经阴离子交换层析柱和镍亲和层析柱纯化获得rPaWap65-2m。采用His-tag pulldown技术验证rPaWap65-2m与血清补体C3 (complement 3)蛋白之间的相互作用。结果表明,P3代病毒储液感染Sf9细胞后,Western blot结果表明r PaWap65-2m以非N-连接糖基化形式表达并分泌至培养基上清。感染复数(multiplicity of infection, MOI)为5且感染72 h后,重组蛋白表达条件最佳。经纯化的rPaWap65-2m纯度大于93%,可用于后续实验。pulldown实验显示rPaWap65-2m蛋白与C3蛋白相互作用。综上,本研究获得了具有生物活性的rPaWap65-2m蛋白,并验证了r PaWap65-2m蛋白与血清中补体C3的相互作用,为后续免疫相关功能研究奠定了基础。
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