| 摘 要： | 为建立特异灵敏的检测牛冠状病毒(BCoV)的Taq Man荧光定量RT-PCR方法,并对犊牛腹泻粪便样品进行检测。本实验根据牛冠状病毒(BCoV)聚合酶基因nsp10核苷酸序列分别设计了1对引物和探针,通过反应体系和条件的优化,建立了检测BCoV的TaqMan荧光定量RT-PCR方法。该方法在3.36×10~1拷贝/μL～3.36×10~9拷贝/μL,质粒标准品与Ct值呈现良好的线性关系,相关系数R~2=0.9996,扩增效率E=109%;该方法只特异性检出BCoV,而不能检出其它常见腹泻病原,特异性较强;对质粒标准品的检测下限为33.6拷贝/μL,与所比较方法的敏感性数量级相同,敏感性较高;批内与批间重复性试验的变异系数均小于5%,重复性较好。该方法对腹泻粪便样品中BCoV检出率高于国外文献报道的TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法。利用该方法对采集自新疆和辽宁的16个养殖场153份犊牛腹泻粪便样品进行了BCoV的检测,BCoV阳性率为71.24%,场阳性率为100%,表明犊牛感染BCoV的现象普遍。本实验首次建立了靶向BCoV聚合酶基因的荧光定量RT-PCR检测方法,其特异性和稳定性好,灵敏度较高,为BCoV的快速检测和流行病学调查提供了有力的手段。
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