| 黑尾叶蝉RNAi途径关键蛋白AGO2多克隆抗体制备及应用 |
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| 引用本文： | 李歌,董旭,危婉婷,叶彦杰,兰汉红.黑尾叶蝉RNAi途径关键蛋白AGO2多克隆抗体制备及应用[J].南方农业学报,2019,50(7). |
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| 作者姓名： | 李歌 董旭 危婉婷 叶彦杰 兰汉红 |
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| 作者单位： | 闽南师范大学教育科学学院,福建漳州,363000;闽南师范大学生物科学与技术学院,福建漳州,363000 |
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| 基金项目： | 国家自然科学基金;福建省自然科学基金面上项目;福建省高等学校杰出青年科研人才培育计划;博士启动基金 |
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| 摘 要： | 【目的】制备效价高且特异性强的黑尾叶蝉RNAi途径关键蛋白Argonaute 2(AGO2)多克隆抗体,为进一步研究AGO2蛋白在叶蝉RNAi免疫途径中的调控功能及作用机制提供技术支持。【方法】通过RT-PCR从黑尾叶蝉基因组扩增出AGO2基因的功能片段,与原核表达质粒pET-28a重组构建重组质粒,然后转化大肠杆菌BL21感受态细胞进行诱导表达;以纯化的AGO2融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔获得高效价的多克隆抗体,并以多克隆抗体为一抗,采用Western blotting检测AGO2蛋白在健康和带毒黑尾叶蝉中的表达情况。【结果】RT-PCR扩增获得的黑尾叶蝉AGO2基因片段为1635 bp,构建的p ET-AGO2重组质粒能在BL21感受态细胞中成功表达出AGO2融合蛋白,其最适表达条件:温度28℃,IPTG浓度0.5 mmol/L,诱导时间5 h,摇床转速220 r/min。以纯化AGO2融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔获得的多克隆抗体效价为1∶106,抗体浓度约350μg/mL。Western blotting检测结果表明,AGO2蛋白在健康和水稻矮缩病毒(RDV)感染黑尾叶蝉中均有表达,但与健康黑尾叶蝉相比,AGO2蛋白在RDV感染黑尾叶蝉中的表达水平更高,即RDV侵染能提高AGO2蛋白的表达水平。【结论】制备获得的黑尾叶蝉RNAi途径关键蛋白AGO2多克隆抗体具有高纯度和高效价,且特异性强,可用于检测AGO2蛋白在病毒感染黑尾叶蝉中的表达水平,进而揭示AGO2蛋白在介体昆虫RNAi途径中的功能机制。
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| 关 键 词： | 水稻矮缩病毒(RDV) 黑尾叶蝉 RNAi AGO2蛋白 多克隆抗体 效价 |
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