| 优化反向PCR法分离转基因油菜外源T-DNA侧翼序列的研究(英文) |
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| 引用本文： | 杨坤,吴学龙,朗春秀,陈锦清.优化反向PCR法分离转基因油菜外源T-DNA侧翼序列的研究(英文)[J].农业科学与技术,2010,11(2). |
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| 作者姓名： | 杨坤 吴学龙 朗春秀 陈锦清 |
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| 作者单位： | 杨坤,YANG Kun(浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华,321004;浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,浙江省植物基因工程代谢重点实验室,浙江杭州,310021);吴学龙,朗春秀,陈锦清,WU Xue-long,LANG Chun-xiu,CHEN Jin-qing(浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所,浙江省植物基因工程代谢重点实验室,浙江杭州,310021) |
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| 基金项目： | 国家高技术研究发展计划(863计划)，浙江省自然科学基金 |
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| 摘 要： | 目的]优化反向PCR(IPCR)条件分离油菜转基因外源T-DNA的侧翼序列。方法]以单拷贝的转基因油菜FS4为研究材料,用SDS法和改良CTAB法(包括低温操作、增加酚氯仿的抽提次数以及延长低温沉淀时间等)提取转基因油菜总DNA,并进行酶切、纯化、自连接,再使用普通聚合酶与热启动高保真的ExTaqHS聚合酶进行两轮巢式PCR扩增,进行序列对比。油菜数据库比对搜索采用BBSRCBrassicaDB上WU-BLAST2.0工具,拟南芥数据库比对分析采用TAIR数据库中WU-BLAST2.0工具。为验证FS4转基因中T-DNA插入位点的真实性,根据序列比对分析结果在T-DNA插入位点的左右两端分别设计引物FS4-L与FS4-R。分别采用3对引物pS2/FS4-L、pA2/FS4-R、FS4-L/FS4-R同时对T1代转基因FS4杂合体和非转基因对照植株的基因组进行PCR验证。结果]两轮巢式PCR扩增得到1个大小为4.0kb的片段,其序列与油菜数据库中BH652424和BZ044084两序列同源性分别高达97.8%和63.4%。根据序列比对结果设计特异引物对进行PCR验证的结果,也证明了FS4转基因油菜中T-DNA的确插入在该位点。结论]优化后的IPCR条件能成功分离油菜转基因外源T-DNA的侧翼序列。
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| 关 键 词： | 反向PCR 侧翼序列 改良CTAB法 转基因油菜 |
Isolation of the Flanking Sequences Adjacent to Transgenic T-DNA in Brassica napus Genome by an Improved Inverse PCR Method |
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| YANG Kun,WU Xue-long,LANG Chun-xiu,CHEN Jin-qing.Isolation of the Flanking Sequences Adjacent to Transgenic T-DNA in Brassica napus Genome by an Improved Inverse PCR Method[J].Agricultural Science ＆ Technology,2010,11(2). |
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| Authors: | YANG Kun WU Xue-long LANG Chun-xiu CHEN Jin-qing |
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| Institution: | 1.College of Chemistry and Life Science; Zhejiang Normal University; Jinhua 321004; 2.The Institute of Virology and Biotechnology; Zhejiang Academy of Agricultural Sciences; Zhejiang Provincial Key Laboratory of Plant Metabolic Engineering; Hangzhou 310021; |
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| Abstract: | Objective] The research aimed to isolate flanking sequences adjacent to the transgenic T-DNA in Brassica napus by an improved inverse PCR method.Method] Using single clone of transgenic FS4 in Brassica napus as the research materials,total DNA was extracted from transgenic Brassica napus by using modified CTAB method.After enzyme digestion and purification,self-joining was made.Two circles of nested PCR and the sequence alignment were carried out.Result] A fragement with the size of 4.0 kb was amplified ... |
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| Keywords: | Inverse PCR (IPCR) Flanking sequences Improved CTAB method Transgenic Brassica napus |
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